徐文慧，孟 军，于维浩，赵海丽，王建文，孔麒森，李 海*

（1.新疆昭苏县畜牧兽医局，新疆 昭苏县 835600；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

抗氧化剂在动物精液冷冻保存中作用的研究进展

徐文慧1，2，孟 军2，于维浩1，赵海丽1，王建文2，孔麒森2，李 海1*

（1.新疆昭苏县畜牧兽医局，新疆 昭苏县 835600；2.新疆农业大学动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

近年来，抗氧化剂在动物精液冷冻保存技术中的研究应用受到广泛关注，通过添加抗氧化剂降低精子在冷冻保存过程中所遭受的氧化损伤，提高了冷冻精液质量和母畜的受胎率。本文从动物精子的氧化损伤机制和常用的抗氧化剂进行综述，期望对精液冷冻技术的相关研究提供理论依据和参考。

抗氧化剂、冷冻精子、动物

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.02.001

随着动物精液低温保存与冷冻保存技术的进一步提高，冻精人工输精已在多种动物繁育中应用，如牛冻精已经成为商业化产品，但也有一些动物精液冷冻效果始终不能满足生产需要，如猪、马等动物。究其原因可能与精液稀释液、冷冻保护剂、平衡时间、冷冻-解冻程序有关。而前人也在这些方面做了大量的研究过工作，尤其是在抗氧化剂方面，大量研究表明向稀释液中添加抗氧化剂能够改善冻融后动物精液活力及精子质膜完整性。本文主要针对氨基酸类、维生素类以及其他抗氧化剂进行综述，期望对动物精液冷冻技术的相关研究提供理论依据和参考。

1 精子在冷冻保存中氧化损伤的机制

在正常的生理条件下，动物精子处于氧自由基（ROS）产生与清除相对稳定的状态下，低浓度的ROS有利于精子获能，高浓度的ROS则会引起精子细胞的氧化应激，使精子质膜发生过氧化损伤，降低精子的受精能力。而动物精液在离心、平衡、冷冻、解冻等操作过程中不可避免的会造成精子损伤，产生ROS,使之发生脂质过氧化反应，降低精子质量，导致受胎率受到影响。诸多研究证实，大量脂质过氧化物的产生是由ROS引发精子膜上的PUFA发生过氧化反应，造成精子的质膜、顶体完整性出现严重损伤[1-3]。精子的顶体是—个膜性帽状结构，覆盖着精子核的前端，含有许多水解酶类。通过顶体反应，使精子能够通过卵外的各层膜并进入卵内。有研究报道，造成精子顶体脱离、损伤、内含物丢失的原因是冷冻-解冻过程中产生过量的氧自由基，从而使精子与卵子识别与融合发生障碍，降低了动物受胎率[4]。因此顶体的完整性对动物的受胎率起关键作用。 此外，过多的氧自由基会导致精子DAN双链断裂，且DNA碱基对氧化应激敏感，这些结构的过氧化能引起碱基修饰和染色质交联，造成精子DNA受损，加快生殖细胞的凋亡速度，从而影响精子的质量，导致动物受胎率降低[5][6]。

2 抗氧化剂在动物精液冷冻保存中的应用

正常细胞主要依靠周围环境和胞内的抗氧化酶和天然抗氧化剂清除多余活性氧。精子作为一类高度分化的特殊细胞，极具简化的细胞质使其丧失了携带大量抗氧化剂和自身修复氧化损伤的能力。因此精子抗氧化途径主要依靠周围环境中的抗氧化物。精子体外保存过程中稀释液即为其所处的环境，在稀释液中添加抗氧化剂对保护精子免受氧化损伤至关重要。

2.1 氨基酸类抗氧化剂

2.1.1 谷氨酰胺

谷氨酰胺是动物机体组织中最丰富的一种游离氨基酸，具有改善机体代谢、氮平衡、促进蛋白质合成、增加淋巴细胞总数的功能。Mustafa等[7]通过精子活力、活率、SOD及精子脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量等指标检测冻融后羊精子质量，发现添加浓度为5 mmol/mL的谷氨酰胺，对羊精子的冷冻保护效果明显。同时在他的另一篇关于抗氧化剂对安哥拉山羊精子的保护作用一文中也得出同样的结果：谷氨酰胺在浓度为0.25 mmol/L、0.5 mmol/L的时候，对羊精子的冷冻保护效果明显[8]。Maissa等[9]在研究谷氨酰胺对马冷冻精子作用机制中得到:谷氨酰胺在浓度为5 mmol/L升时，对马精子有保护作用。因此，不同动物的精子对同一种抗氧化剂的浓度要求具有很大的差异。

2.1.2 牛磺酸

牛磺酸（Taurine）是一种广泛存在动物机体内含量最丰富的自由氨基酸，通过稳定电子链、抑制活性氧的产生来改善线粒体功能，进而对细胞起到保护和抑制凋亡的作用。杨建成、刘梅[10]等在研究牛磺酸对大鼠睾丸组织抗氧化影响中得到：通过在饮用水中添加牛磺酸，可明显提高大鼠特别是老龄大鼠睾丸组织的SOD活性,清除氧自由基，降低对睾丸组织的损害程度。李方方[11]等在基础日粮中添加不同量的牛磺酸，发现添加6 g/kg牛磺酸可提高种公猪的性欲、采精量 、精子活力，降低种公猪精浆丙二醛（MDA）含量，而在饲粮中长期添加牛磺酸可以调控种公猪血清激素含量，增加精浆抗氧化能力，进而增强种公猪性欲，提高种公猪精液品质。Mustafa等[8]发现添加浓度为25 mmol/L的牛磺酸，可有效提高羊精子活力、活率、SOD含量，降低精子脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。

2.1.3 半胱氨酸

半胱氨酸是一种具有还原性的含硫氨基酸，具有解毒、溶解角质、抗衰老的作用，与甘氨酸、谷氨酸共同组成谷胱甘肽。此外，半胱氨酸是不稳定的化合物，容易氧化还原，所以在精液冷冻过程中可以对精子质膜起到保护作用。程彩虹等[12]研究认为添加半胱氨酸对冻融后羊精子存活数量和顶体完整性具有保护和提高作用；而在范楚宁[13]关于半胱氨酸对獭兔冷冻精液影响中也得出同样的结果。张旭成等[14]发现在稀释液中添加半胱氨酸可以提高冻融后精子的活率和顶体完整性，通过膜脂质过氧化反应检测发现MDA浓度显著降低。B.Khalili.M.[15]研究发现在羊冷冻精液中添加浓度为5 mmol/L和15 mmol/L的半胱氨酸，以浓度为15 mmol/L保护精子质量最好。

2.2 维生素类抗氧化剂

2.2.1 维生素E

维生素E是有机体重要的抗氧化剂，又名生育酚。VE具有调节性激素分泌的功能，可促进性激素分泌，使动物精子活力和数量增加。且由于VE易被氧化，从而有效对抗自由基，抑制过氧化脂质生成，避免精子膜受到氧化损伤[16]。韩鹏，王尚乾[17]等将水溶性VE添加到精液冷冻保护液中发现一定浓度的VE可以减少精子冻融过程中产生的过量ROS，降低对精子质膜的氧化应激性损伤，提高冻融后的精子质量。罗海玲等[18]在绵羊冷冻精液中添加维生素E，冻融后,试验组活率极显著高于对照组（P＜0.01），说明一定量的维生素E对精子的冷冻保护是有益的。权富生等[19]在探讨在无角道塞特绵羊冷冻精液稀释液中添加VB12、VE、VC对精子冷冻品质的影响一文中也得出同样结果：添加VE后能够极显著提高冷冻精子的顶体完整率。A.J.Michael[20]在研究犬冷冻精子时发现VE可以显著提高精子冻后活力。

2.2.2 维生素C

维生素C又称为抗坏血酸,参与机体内重要物质的合成与分解，具有较强的还原性，对精子脂质过氧化反应可以起到很好的对抗作用，可有效提高冻后精子品质。除此之外，有研究认为维生素C具有缓解热应激作用，可以有效防止精子解冻时和解冻后保存时因精液温度变化迅速，而对细胞膜造成的损伤[21]。任俊玲等[22]研究证实，添加维生素C可以有效提高猪精液冻融后的活力、活率、质膜完整率、顶体完整率，而权富生等[19]研究发现在冷冻精液中添加4.4 g/L维生素C能够显著提高解冻后的羊精子活率（P＜0.05），但对冷冻后精子的顶体完整率无影响。

2.3 其他抗氧化剂

褪黑素，主要是由哺乳动物的松果体产生的一种胺类激素，可通过清除自由基，抗氧化和抑制脂质的过氧化反应保护细胞结构、防止DNA损伤、降低机体过氧化物的含量。杜立银等[23]研究发现添加1×10-5mol/LMLT可以抑制 ROS诱发的精子氧化损伤,降低丙二醛含量 ,可有效改善精子运动性、质膜完整性 、顶体完整性和线粒体膜活性;李晓霞等[24]研究发现在稀释液中添加10-3mol/LMLT可明显改善牛精液品质，提高牛精液的保存时间和保存质量。李博玲等[25]人认为在稀释液中添加褪黑素可有效提高猪精液冻后质量，而以添加0.25 mg/mL效果最好。

3 小结与展望

动物精液冷冻保存可以有效解决因鲜精保存时间短，地域限制导致推广困难以及优质种公畜购置饲养成本过高等问题，就目前来看，牛冻精已经全面推广，在其他动物上还处于研究状态，其原因在于精子在冻融过程中产生过多的活性氧，并与精子质膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，从而使精子质膜受到损伤，降低精子品质，因此多年来人们一直尝试在稀释液中添加抗氧化剂来清除冻融过程中产生的活性氧，提高精子品质，但是研究结果不尽一致，还需要进一步深入研究和分析。此外，在诸多研究中单独添加抗氧化剂的研究较多，而联合添加较少，尤其是氨基酸类抗氧化剂可以在一定条件下相互转换、分解、合成，这就需要研究者对这类抗氧化剂进行深入了解，才能找到最佳适合冷冻精子的抗氧化剂。

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Research Progress of Anti-oxidants in Cryopreservation of Animal Semen

XU Wen-hui1,2，MENG Jun2，YU Wei-hao2，ZHAO Hai-li1，WANG Jian-wen2，KONG Qi-seng2，LI Hai1*
（1.Zhaosu Bureau of Animal Husbandry,Zhaosu Xinjiang 835602，China；2.College of Animal Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China）

In recent years,the research and application of antioxidants in cryopreservation of animal semen has been paid more and more attention.By adding antioxidants,the oxidative damage of spermatozoa during cryopreservation is reduced,and the quality of frozen semen and the conception rate of females are improved. In this paper,we reviewed the mechanism of oxidative damage in animal spermatozoa and the commonly used antioxidants.Wehopetoprovidethetheoreticalbasisand reference fortheresearch ofsemen cryopreservation.

Antioxidants,frozen sperm,animals

S814

A

1003－6377（2017）02－0001-05

农业科技成果转化资金项目“马细管精液人工授精技术的应用与推广”(2014GB2G400154)

徐文慧（1985-），女，甘肃酒泉人，在读硕士研究生，研究方向：马繁殖。E-mail:1442582668@qq.com

李海（1980-），男，高级畜牧师，主要从事草原畜牧业管理与技术推广。E-mail:1479615209@qq.com

2017-01-02，

2017-01-28