孙蓓，王龙刚

（1.江苏徐州医药高等职业学校，江苏徐州 221116；2.江苏联益生物科技有限公司，江苏淮安 211799）

三文鱼下脚料制备鱼味香料的研究

孙蓓1，王龙刚2

（1.江苏徐州医药高等职业学校，江苏徐州 221116；2.江苏联益生物科技有限公司，江苏淮安 211799）

以三文鱼的加工下脚料为原料，经酶解和美拉德反应，制备香味浓郁的鱼味香料。通过分析水解液中氨基酸组成，确定美拉德反应中所需添加的氨基酸，单因素试验和正交试验确定美拉德反应的基本配料和反应条件。结果表明：水解液中含有18种氨基酸，半胱氨酸含量较少，制备鱼味香料的最佳工艺为：添加4%葡萄糖、1.6%半胱氨酸、1%硫胺素以及1%酵母粉，调节pH至7.0，110℃反应50min。

三文鱼下脚料；鱼味香料；酶解；美拉德反应；氨基酸；正交试验

三文鱼学名鲑鱼，又名撒蒙鱼或萨门鱼，是世界著名经济鱼类之一。三文鱼不仅富含不饱和脂肪酸，包含18种氨基酸（包括8种必需氨基酸）［1］，蛋白质含量明显高于其他鱼类，还含有Ca，P，Mg等多种矿质元素，被誉为“水中珍品”［2，3］。市场上的三文鱼通常以新鲜或冷冻的切片方式出售，加工过程中产生大量的下脚料。三文鱼油脂含量高、色泽重、腥味大，给三文鱼下脚料的综合利用带来困难。

美拉德反应主要是指还原糖与氨基酸、多肽之间的复杂反应［4，5］，现一般将其分为初期、中期、终期三个阶段［6－9］，是食品加工中各种风味及色泽的重要来源。由于该技术打破了传统生产工艺的范畴，所形成的香味逼真，是调配技术无法比拟的，且无论是反应还是产物均可视为天然的，因此已受到越来越多的关注［10］。

本文以三文鱼下脚料为原料，经酶解和美拉德反应，制得了鱼香味浓郁的鱼味香料，为三文鱼下脚料的综合利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三文鱼下脚料 青岛广浩金水产有限公司；风味蛋白酶（20000U/g） 广西南宁庞博生物有限公司；葡萄糖、L-半胱氨酸、NaOH、HCl等（均为分析纯）国药试剂公司。

AUX-J20绞肉机 佛山市海迅电器有限公司；CP124C先行者精密电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海森信实验仪器有限公司；TDZ5-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；K360凯式定氮仪 瑞士Buchi公司；全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 三文鱼下脚料水解液的制备

将三文鱼下脚料置于4℃冰箱中解冻12h，加入绞肉机中绞碎，按料水比1∶2加入蒸馏水混匀，根据风味蛋白酶的理论最适反应条件［11］，用2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，50℃水浴锅中保温15min，加入风味蛋白酶水解一定时间，沸水浴灭酶10min，冷却后于5000r/min离心15min，弃去上层脂肪及沉淀即为三文鱼下脚料的水解液。

1.2.2 美拉德反应产物的制备

取50mL水解液于100mL三角瓶中，加入4%葡萄糖、1%半胱氨酸、1%硫胺素以及1%酵母粉，采用1mol/L HCl或NaOH调节pH至7.0，于高压灭菌锅中110℃反应40min，迅速冷却后进行感官评定。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 酶解时间的选择

分别取酶解时间为1，2，3，4，6，8h的水解液按照1.2.2条件进行反应，对不同酶解时间水解液所得产物进行感官评定。

1.2.3.2 葡萄糖用量的确定

在1.2.3.1结果的基础上，改变葡萄糖用量分别为1%，2%，3%，4%，5%，其他条件同上，对所得产物进行感官评定。

1.2.3.3 还原糖与氨基酸比例的确定

在1.2.3.2结果的基础上，设定还原糖与L-半胱氨酸比例分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，其他条件同上，对所得产物进行感官评定。

1.2.3.4 温度对美拉德反应产物的影响

在1.2.3.3结果的基础上，设定反应温度分别为95，100，105，110，115℃，其他条件同上，对所得产物进行感官评定。

1.2.3.5 pH对美拉德反应产物的影响

在1.2.3.4结果的基础上，调节反应pH值分别为4，5，6，7，8，其他条件同上，对所得产物进行感官评定。

1.2.3.6 反应时间对美拉德反应产物的影响

在1.2.3.5结果的基础上，设定反应时间分别为30，40，50，60，70min，其他条件同上，对所得产物进行感官评定。

1.2.4 正交试验

在单因素实验基础上，按表1进行L9（33）正交试验设计，进一步优化美拉德反应温度、时间和pH值。对所得实验结果进行极差分析，得出最佳工艺组合。

表1 L9（33）正交试验因素水平表Table 1Factors and levels table of L9（33）orthogonal test

1.2.5 水解度的测定

采用甲醛滴定法测定水解液中游离氨基氮含量，凯式定氮仪测定总氮含量，根据下式计算蛋白质水解度：

1.2.6 氨基酸测定方法

分别取酶解时间为2，3，4，6，8，10h的水解液，采用全自动氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸的种类及含量。

1.2.7 感官评定方法［12］

采用评分法进行感官评定，选取10名经过专业培训的感官评定员，首先对其讲解感官评定要求，把样品编号后分别提供给评定员，分别对样品的色泽、鱼香味，及腥味进行品评，每次品评后，用清水漱口，等待1min后再品评下一个产品，感官评定期间不允许互相交流。根据表2的评定标准对每个样品进行评分，记录样品的品评分数，最后得分取该样品得分的平均值。感官评定标准见表2。

表2 感官评定标准Table 2Standard of sensory evaluation

1.2.8 数据处理方法

感官评定结果取平均值，采用Orgin 8.0作图，正交设计助手Ⅱ设计正交试验并进行极差分析，SAS软件进行差异显著性分析，显著水平为0.05。

2 结果与讨论

2.1 水解液中氨基酸分析结果

不同时间水解液中氨基酸组成见表3。

表3 酶解过程中游离氨基酸组成Table 3Composition of free amino acids during hydrolysis process

由表3可知，水解液中共检测出18种氨基酸，其中包括8种必需氨基酸，说明三文鱼下脚料水解产物中氨基酸种类较为齐全。从氨基酸总量来看，随着酶解时间的延长，水解液中氨基酸含量逐渐增加，当水解时间超过8h后，氨基酸总量无明显变化，说明水解度在8h达到最大值。大多数氨基酸含量均随着水解时间的延长而增加，但少数几种如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等在8h后出现了下降的趋势，这可能跟酶解过程中类蛋白的合成有关。

比较18种氨基酸的含量可知，水解液中天冬氨酸和甘氨酸含量最高，在1h便达到1000μg/mL以上，其次为赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸，而半胱氨酸、脯氨酸和色氨酸的含量均较低。在美拉德反应中，氨基酸的种类和含量对产物风味具有重要影响，如甲硫氨酸反应可产生土豆味，脯氨酸和还原糖反应生成烤面包味，酪氨酸可产生焦香味，而半胱氨酸在美拉德反应中可生成肉香味的前体物质，对肉类风味的形成至关重要［13］。而水解液中只含有较少的半胱氨酸，无法满足美拉德反应的需求，因此，在美拉德反应过程中应添加适量半胱氨酸，使产品的鱼肉香味更加浓郁。

2.2 美拉德反应基本配料的确定

2.2.1 酶解时间的确定

酶解时间不同，水解液中氨基酸和肽链的组成及含量均不同，所得美拉德反应产物风味也具有较大差异。由表3可知，当酶解时间超过8h时，水解液中氨基酸组成无显著变化，因此，选择酶解时间分别为1，2，3，4，6，8h来考察水解度对美拉德反应产物的影响，实验结果见图1。

图1 不同酶解时间感官评定结果Fig.1The sensory evaluation results of different digestion time

由图1可知，随着酶解时间的增加，水解液的水解度不断增长，当超过4h时增长减慢，6h以后趋于平缓。而美拉德反应产物的感官评分在1～3h显著增加，当酶解时间太短时，水解液中没有生成足够的氨基酸和肽链，美拉德反应产物呈浅褐色，鱼香味较淡，有腥味；当水解时间为3h时，感官评分达到最大值，产物具有浓郁的鱼香味，且腥味较淡；当超过3h时感官评分逐渐降低，且3～4h之间差异不显著，说明并不是水解度越高产物风味越好，风味物质的形成是水解液中氨基酸、多肽以及蛋白质共同作用产生的。因此，选择3h为最适的酶解时间。

2.2.2 还原糖用量的确定

还原糖的用量对美拉德反应速度具有重要影响，一般来说，还原糖的增加会加速反应进行，但过量的还原糖会导致一些不利于产品风味的物质产生。

图2 不同还原糖用量感官评定结果Fig.2The sensory evaluation results of different reducing sugar consumption

由图2可知，随着葡萄糖用量的增加，产物感官评分显著提高，但当葡萄糖用量超过4%时，感官评分开始下降。原因可能是当还原糖加入较少时，小分子风味物质随着还原糖的增加不断生成，超过一定水平，小分子风味物质达到饱和，开始合成感官较差的大分子物质，影响产品风味，甚至掩盖了原有风味。因此，确定还原糖加入量为4%。

2.2.3 还原糖与氨基酸比例的确定

美拉德反应主要是还原糖和氨基酸之间的反应，因此，控制好两者的比例对反应产物的风味、色泽、口感都有重要作用。还原糖与氨基酸比例对美拉德反应的影响结果见图3。

图3 不同还原糖与氨基酸比例感官评定结果Fig.3The sensory evaluation results of different proportion of reducing sugar and amino acids

当还原糖与氨基酸比例为5∶1时，产物呈褐色，鱼香味不够浓郁，略带有腥味。随着氨基酸的比例增加，L-半胱氨酸经Strecker降解，首先产生巯基乙醛，再继续分解产生乙醛和H2S，最后形成噻吩、噻唑等具有特征风味的含硫化合物［14］，鱼香味变得浓郁。当还原糖与氨基酸比例达到5∶2时，感官评分达最大值，继续增加氨基酸比例，过量生成了多余的H2S，产生硫臭味，影响整体风味，感官评分显著降低，产品腥味加重，逐渐掩盖了原有的鱼香味。因此，选择还原糖与氨基酸比例为5∶2。

2.3 反应条件优化

2.3.1 温度对美拉德反应的影响

温度不仅影响美拉德反应底物的活化能，还会影响反应进行速度。每种风味物质的产生都有自身特定的活化能，因此，不同的温度导致产品风味的不同［15］，一般情况下，升高温度有利于加快反应速度［16］，但过高的温度不仅会破坏产品的营养物质，还会导致类黑精积累，影响产品色泽，甚至产生致癌物质。

反应温度对美拉德反应的影响结果见图4。

图4 不同反应温度感官评定结果Fig.4The sensory evaluation results of different reaction temperatures

由图4可知，随着美拉德反应温度的升高，感官评分逐渐升高，鱼香味浓郁，腥味减弱，105℃时达到最高值，但继续升高温度，感官评分开始下降，色泽开始变得浑浊，呈深褐色，并出现焦味。因此，选择105℃为美拉德反应最佳温度。

2.3.2 初始pH对美拉德反应的影响

Maillard反应中的许多步骤是酸碱催化的反应，因此，pH的改变不仅会影响美拉德反应的反应速率，还会改变其反应方向和反应产物的形成。一般来说，升高pH会使美拉德反应速度加快［17］，但pH大于8时，反应过快而难以控制［18］。

初始pH对美拉德反应的影响结果见图5。

图5 不同反应pH感官评定结果Fig.5The sensory evaluation results of different reaction pH

由图5可知，pH的改变对产品风味具有显著影响。当pH较低时，反应速度较慢，感官评分较低，香味较弱，腥味较重，色泽较为浑浊；随着pH的升高，鱼香味逐渐浓郁，感官评分升高；当pH为6.0时，评分最高；当pH大于6.0时，感官评分开始下降；pH 6.0～7.0之间差异不显著；但当pH升至8.0时，感官评分出现显著下降，可能是反应过快导致不利于产品风味的物质生成。因此，选择pH 6.0为最佳反应pH。

2.3.3 反应时间对美拉德反应的影响

时间主要是对Maillard反应的动力学方面产生影响［19］。改变反应时间能改变最终风味化合物的平衡，进而改变风味特征。反应时间太短，产生的风味物质较少，香气不够；反应时间过长，容易产生过度的焦糖化反应，产生苦味，使产品整体风味较差。

反应时间对美拉德反应的影响结果见图6。

图6 不同反应时间感官评定结果Fig.6The sensory evaluation results of different reaction time

随着美拉德反应时间的延长，小分子风味化合物不断合成，感官评分逐渐升高，反应至50min时感官评分最高，鱼香味最为浓郁，继续延长反应时间，开始产生一些不愉悦的风味，影响了产品的整体风味，感官评分出现显著降低。因此，选择50min为最佳反应时间。

2.4 正交试验结果

对美拉德反应制备鱼味香精的反应温度、pH、时间进行正交试验优化，实验结果及极差分析结果见表4。

表4 美拉德反应正交试验结果Table 4Orthogonal test results of Maillard reaction

由表4可知，各因素对美拉德反应的影响大小不同，其顺序为B＞C＞A，即pH影响最大，其次为反应时间和温度，由k值可得美拉德反应条件的最佳组合为A3B3C2，即温度110℃，pH 7.0，反应时间50min，恰为正交试验中的实验9。经验证试验表明：在此条件下感官评分为8.7分，说明正交试验所优化出的结果符合实际。

3 结论

通过单因素试验和正交试验优化美拉德反应的基本配料和反应条件，得出反应最佳工艺为：添加4%葡萄糖、1.6%半胱氨酸盐酸盐、1%硫胺素以及1%酵母粉，调节pH至7.0，110℃反应50min。在此条件下，所得鱼味香料香味浓郁，且没有原料所带有的鱼腥味，为三文鱼下脚料的综合利用提供了参考。

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Research on the Preparation of Fishy Spices with Salmon Scraps

SUN Bei1，WANG Long－gang2
（1.Jiangsu Xuzhou Pharmaceutical Higher Vocational School，Xuzhou 221116，China；2.Jiangsu Lianyi Biological Technology Co.，Ltd.，Huaian211799，China）

Aromatic-flavor fishy spices are prepared with salmon scraps with the method of enzymatic hydrolysis and Maillard reaction.The amino acids added in Maillard reaction is determined through the analysis of amino acids in hydrolyzate.Single-factor test and orthogonal test are applied to determine the basic ingredients and conditions of Maillard reaction.The results show that 18types of amino acids are detected in hydrolyzate，and there is less content of cysteine，the optimum reaction conditions are：glucose of 4%，cysteine of 1.6%，sulfate of 1%，yeast of 1%，pH of 7.0，temperature of 110℃，time of 50min.

salmon scraps；fishy spices；enzymatic hydrolysis；Maillard reaction；amino acids；orthogonal test

TS202.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.022

1000-9973（2017）03-0094-05

2016－09－07

孙蓓（1983－），女，硕士，研究方向：食品科学。