刘欣伟，柳云恩，张玉彪，侯明晓，赵 勇，周大鹏，项良碧

·论 著·

抗生素/β-磷酸三钙/多孔丝素蛋白支架修复兔桡骨骨缺损的实验研究

刘欣伟，柳云恩，张玉彪，侯明晓，赵 勇，周大鹏，项良碧

目的 探讨抗生素/β-磷酸三钙/多孔丝素蛋白支架修复兔桡骨骨缺损的效果。方法 制备再生丝素蛋白胶囊型载药人工骨修复材料，成年大白兔16只，随机分为A组[不载药材料：SF(多孔丝素蛋白支架)+β-TCP(β-磷酸三钙)]、B组(载药材料：SF+β-TCP+万古霉素)，每组8只(16例桡骨)。桡骨构建桡骨骨缺损模型后植入材料，于术后第28、56、84、112天观察兔的一般情况(感染发生后退出观察)，并在第84天和112天时随机处死一半的兔子，观察骨愈合的组织学表现。结果 A组4只兔(8例桡骨)6～7d发生感染，B组无感染发生，A组感染发生率明显高于B组(χ2=8.167，P=0.004)；术后84d，A组2只兔(4例桡骨)及B组3只兔(6例桡骨)得到满意骨修复效果，组织学切片观察两组对比无明显差异，都可以看到新生骨质、少量β-磷酸三钙及丝素蛋白支架的残余，B组1只兔(2例桡骨)出现双侧假关节；术后112d，A组1只兔(2例桡骨)及B组4只兔(8例桡骨)得到满意骨修复效果，组织学切片观察与术后84d相仿且两组对比无明显差异，但可见更多的新生骨质，A组1只兔(2例桡骨)出现肢体屈曲痉挛，桡骨缺损修复效果不佳。结论 抗生素/β-磷酸三钙/多孔丝素蛋白支架由于丝素蛋白的组织相容性好，多孔的结构允许外周的干细胞，包括成骨细胞向管壁内迁移，加之含有抗生素成分，对骨缺损修复及预防感染有较好的效果。

桡骨； 骨缺损； 抗生素； β-磷酸三钙； 丝素蛋白； 修复； 兔

随着我国工业、交通运输业的发展，骨折的发生率逐年上升，在骨科医师的临床工作中，高能量创伤所致的粉碎性骨折、骨缺损治疗起来较为棘手，若软组织条件较差，加之合并开放伤口，常会合并骨感染的发生，其中一些甚至成为创伤骨科临床工作中的难点[1-2]。课题组通过包裹万古霉素及β磷酸三钙(β-TCP)的多孔丝素蛋白制备的抗生素/β-磷酸三钙/多孔丝素蛋白支架进行了修复兔桡骨骨缺损的研究，现报告如下。

材料与方法

1 主要试剂

碳酸氢钠(NaHCO3)，溴化锂(LiBr)，正丁醇(C4H9OH)，无水乙醇(C2H5OH)，氢氧化钠(NaOH)，醋酸(CH3COOH)，透析袋(再生纤维素)，聚乙二醇(PEG)，盐酸万古霉素，β-磷酸三钙(β-TCP)，试剂由沈阳军区总医院药学部提供。

2 实验方法

2.1 β-TCP的多孔丝素蛋白胶囊的制备 将浓度为10wt%的丝素蛋白液在室温环境(25℃左右)进行搅拌，搅拌后按照2∶1的体积比加入正丁醇，继续稳定2min。将丝素蛋白/正丁醇混合液倒入预先准备好的模具中，置于控-20℃冰箱内冷冻24h。之后给予解冻，得到粗糙的丝素蛋白多孔支架。再将其浸入去离子水中，经过多次洗涤将其中的正丁醇去除，得到白色提纯后的丝素蛋白多孔支架。再置入-70℃冰箱中进行冷冻干燥后将其切割成1.5cm备用。

利用球磨仪将β-磷酸三钙(β-TCP)和万古霉素以质量比1∶4的配比进行混合搅拌。再将万古霉素/β-磷酸三钙混合物铺满多孔丝素蛋白支架，在该支架的两端通过丝素蛋白溶液进行薄膜化封堵，干燥后得到了本研究中使用的抗生素/β-磷酸三钙/多孔丝素蛋白支架。

2.2 材料的体内植入实验 (1)兔桡骨大段骨缺损建模：取成年大白兔16只，雌雄不限，10周龄，体重(2.5±0.3)kg，桡骨长(57±3.5)mm。所有动物均经检查证实无外伤、四肢畸形、感染、腹泻等异常情况。给予3%戊巴比妥钠按30mg/kg于耳缘静脉进行麻醉，术区备皮，常规消毒、铺无菌手术单，取双前臂内侧切口，逐层分离并显露桡骨干，于桡骨中段以线锯将尺桡骨磨断，在钢尺测量下造成长1.5cm骨缺损模型。(2)骨缺损修复：A组仅在丝素蛋白胶囊中加入β-TCP；B组植入包裹万古霉素及β-TCP的多孔丝素蛋白胶囊(SF+β-TCP+万古霉素)。按随机数字表法随机选取16只兔，其中A、B组各8只。再以解剖复位的方式将骨折端对位对线良好，将1.5cm大小的管状材料崁入骨折端，骨折端与植入材料间贴合完好，无软组织及凝血块嵌入，生理盐水反复冲洗伤口，全层缝合皮肤及皮下组织。为防止干扰B组中万古霉素预防感染的效果，并考虑手术为无菌操作，兔子手术后伤口局部不予外敷抗生素粉末，术后全部兔均予常规饲养，术后观察护理，于术后84、112d随机处死一半的动物并进行观察。

2.3 观察指标 (1)一般情况及感染情况观察：待兔于手术麻醉苏醒后，对兔的生存、进食、伤口愈合包括伤口红肿、流脓等情况、精神状态、活动等情况进行观察并记录。(2)通过HE染色观察骨修复情况：对骨愈合端处的组织进行固定、脱钙、石蜡包埋，HE染色观察。

3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，使用χ2检验。P<0.05认为统计学上存在显著性差异。

结 果

全部16只兔术后30min内均正常苏醒，未出现因麻醉原因导致的死亡。至术后2d，均恢复正常精神状态及喂食。按照伤口红肿、持续渗液、流脓作为感染评判标准，感染发生后即退出研究。A组4只兔(8例桡骨)6～7d发生感染，B组无感染发生，A组感染发生率明显高于B组(χ2=8.167，P=0.004)；术后84d，A组2只兔(4例桡骨)及B组3只兔(6例桡骨)得到满意骨修复效果，组织学切片观察两组对比无明显差异，都可以看到新生骨质、少量β-磷酸三钙及丝素蛋白支架的残余，B组1只兔(2例桡骨)出现双侧假关节；术后112d，A组1只兔(2例桡骨)及B组4只兔(8例桡骨)得到满意骨修复效果，组织学切片观察与术后84天相仿且两组对比无明显差异，但可见更多的新生骨质，A组1只兔(2例桡骨)出现肢体屈曲痉挛，桡骨缺损修复效果不佳;见图1。

a b c d

图1 a、b.A组、B组术后84d桡骨得到满意骨修复效果，可以观察到新生骨质，少量三磷酸钙及丝素蛋白支架的残余；c、d.A组、B组术后112d可见更多的新生骨质

讨 论

随着社会工业、交通运输业的发展，骨折的发生率亦逐年上升，在各种骨折类型中，粉碎性骨折合并骨缺损一直以来是骨科医师需经常面临的棘手问题，以往是利用自体骨、同种异体骨等方法来解决骨缺损的重建[3-4]。然而，这些传统的植骨方式各有利弊，自体骨来源有限，且增加了对患者的创伤，供骨区常会发生疼痛、瘢痕等并发症，增加了患者心理、生理负担；同种异体骨涉及到排异反应且价格不菲，一定程度上限制了其应用。另外，高能量损伤往往合并不同程度的软组织损伤甚至开放性损伤，这大大增加了感染的风险，而涉及到内植物的感染若发展成骨髓炎，其结果将是灾难性的，因此，预防感染亦是内固定手术治疗骨折中不可忽视的一个重要问题[5-6]。鉴于骨缺损、骨感染均为骨科医师在临床中需经常面对的棘手问题，多年来，学者们一直在进行探索，伴随着新能源、新材料开发步伐的不断加速，组织工程技术的出现及进步为解决此类难题提供了新的方向。组织工程的相关领域主要针对生物材料研发、组织和器官的构建方法及技术、干细胞应用、组织工程的临床应用，其中生物材料的开发随着材料学的发展有了日新月异的进步[7-10]。

近年来，天然大分子生物材料以其生物相容性的优势成为组织工程研究中生物材料的热点，学者们对蚕丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸等进行了研究[11-12]。我国将蚕丝用作纺织材料有悠久的历史，丝素蛋白(又名丝素蛋白)是蚕丝的重要组成成分，结构主要包括高度有序的β-sheet结晶区和半结晶区(体现蚕丝的弹性)，其二级结构具有很好的稳定性和优良的机械性能，由于其良好的生物学特性、环境稳定性及友好性，便于分子操作，使得其近年来成为组织工程生物材料的研究热点之一[13-15]。β-磷酸三钙(β-TCP)作为生物支架材料是细胞黏附、生长和矿化的平台，其在体内可通过体液溶解后被机体吸收，在这个过程中完成新生骨的替代过程，且其溶解后的组织液中富含钙质，给成骨细胞的成骨作用很好地提供了原料，在组织工程研究中已被学者广泛认同[16]。

课题组结合多年的创伤骨科临床体会，在组织工程研究平台的基础上开发了多孔丝素蛋白并将其制备成中空结构，其内填充万古霉素及β-TCP，利用其多孔性原理实现了万古霉素的缓释作用及钙盐的缓慢降解、释放及吸收。β-TCP能够在成为成骨细胞支架的同时为骨缺损修复提供原料，同时胶囊缓释的万古霉素也能够起到预防感染的作用。本次实验也表明：该材料组织相容性较好，在该中空管状多孔支架内填充β-TCP和万古霉素，用来修复大段的兔骨缺损，其原理不似以往的自体骨及同种异体骨植骨，但也能取得较好的骨修复效果，同时其预防感染效果亦较为明显。本研究中的12周和16周组织学观察的结果中均可以看到新生的骨、残余的磷酸三钙，骨修复效果良好，其可能原因是因为在多孔丝素蛋白较好的组织相容性及缓释效果的基础上，为骨修复提供了原料，并且其多孔结构允许外周的组织细胞包括成骨细胞通过管壁向内进行爬行替代，从而完成骨缺损的修复。

综上所述，包裹万古霉素及β-TCP的多孔丝素蛋白胶囊由于其组织相容性、缓释作用、多孔的结构等特点，对骨缺损修复及预防感染有较好的效果，这为将来临床上治疗骨缺损及预防感染提供了新的思路。

[1] 欧阳毅，夏媛优，张一辰,等.3种麻醉方法在兔骨缺损修复术中的比较[J].重庆医学,2014,43(11):1348-1350.

[2] 罗菲，张纲.颌骨缺损修复的研究进展[J].重庆医学,2012,41(36):3897-3900.

[3] Calori GM,Mazza E,Colombo M,et al.The use of bone-graft substitutes in large bone defects: any specific needs[J].Injury,2011,42(S2):S56-63.

[4] Zhao M,Zhou J,Li X,et al.Repair of bone defect with vascularized tissue engineered bone graft seeded with mesenchymal stem cells in rabbits[J].Microsurgery,2011,31(2):130-137.

[5] Hagen J,Chansky H,Nork SE,et al.Salvage of an infected periprosthetic failed fracture fixation in a Nonagenarian[J].Geriatr Orthop Surg Rehabil,2013,4(2):39-42.

[6] Robinson DA,Bechtold JE,Carlson CS,et al.Development of a fracture osteomyelitis model in the rat femur[J].J Orthop Res,2011,29(1):131-137.

[7] Yan LP,Silva-Correia J,Correia C,et al.Bioactive macro/micro porous silk fibroin/nano-sized calcium phosphate scaffolds with potential for bone-tissue-engineering applications[J].Nanomedicine,2013,8(3):359-378.

[8] Barrett DG,Yousaf MN.Design and applications of biodegradable polyester tissue scaffolds based on endogenous monomers found in human metabolism[J].Molecules,2009,14(10):4022-4050.

[9] Novosel EC,Kleinhans C,Kluger PJ.Vascularization is the key challenge in tissue engineering[J].Adv Drug Deli Rev,2011,63(4):300-311.

[10] Smith IO,Ma PX.Biomimetic scaffolds in tissue engineering[M].Tissue Engineering.Springer Berlin Heidelberg,2011:31-39.

[11] Wang Y,Bella E,Lee CS,et al.The synergistic effects of 3-D porous silk fibroin matrix scaffold properties and hydrodynamic environment in cartilage tissue regeneration[J].Biomaterials,2010,31(17):4672-4681.

[12] Kundu B,Rajkhowa R,Kundu SC,et al.Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations[J].Adv Drug Deliv Rev,2013,65(4):457-470.

[13] Altman GH,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk-based biomaterials[J].Biomaterials,2003,24(3):401-416.

[14] Bhattacharjee M,Schultz-Thater E,Trella E,et al.The role of 3D structure and protein conformation on the innate and adaptive immune responses to silk-based biomaterials[J].Biomaterials,2013,34(33):8161-8171.

[15] Wray LS,Hu X,Gallego J,et al.Effect of processing on silk-based biomaterials: Reproducibility and biocompatibility[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2011,99(1):89-101.

[16] 万蕾蕾，刘宏伟.β磷酸三钙符合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究[J].口腔医学研究，2010,26(4)：497-500.

(本文编辑： 黄利萍)

Experimental study of antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold repairing rabbit radial bone defect

LIUXin-wei1,2,LIUYun-en2,ZHANGYu-biao2,HOUMing-xiao2,ZHAOYong1,ZHOUDa-peng1,XIANGLiang-bi1

(1.Department of Orthopedics,General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Shenyang 110016，China; 2.Laboratory of Severe Wound and Trauma of Chinese PLA, Shenyang 110016,China)

Objective To investigate the effect of antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold repairing rabbit radial bone defect. Methods Regenerated silk fibroin capsules for artificial bone repair materials were prepared. Sixteen adult white rabbits were randomly divided into group A (SF+beta TCP for repairing bone defect) and group B (SF+beta TCP+vancomycin for repairing bone defect). There were 8 rabbits (16 radius) in each group. Radial bone defect model was constructed after implanting materials. The rabbits were executed at 28,56,84 and 112 days postoperatively to observe the general situation. If infection occurred,rabbits were withdrawn from the observation. Half of the rabbits were executed after 84 and 112 days to observe the histologic findings of bone healing. Results Four rabbits in group A (8 cases of radius) occurred infection about 6 to 7 days after operation. Cases in group B were without infection,The incidence of infection in group A was significantly higher than that in group B(χ2=8.167，P=0.004). Bone repair effect in 2 rabbits in group A(4 cases of radius) and 3 rabbits in group B(6 cases of radius) was satisfactory. There was no significant difference between the two groups in the histological observation. Histological observation can see the new bone,a small amount of β-three calcium phosphate and silk fibroin scaffold residues,but 1 rabbit in group B was with bilateral false joints after 84 days. After 112 days,bone repair effect in 1 rabbit in group A(2 cases of radius) and 4 rabbits in group B(8 cases of radius) was satisfactory,Histological section observation result was similar to that after 84 days and no significant difference between the two groups,but more new bone mass was seen,only 1 rabbits in group A occurred buckling spasm. Conclusion Antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold has good histocompatibility. Porous structure allows peripheral stem cells,including osteoblasts to move within the tube wall. Also,it contains antibiotics. All these are good for bone defect repair and infection prevention.

radius; bone defect; antibiotics; β-three calcium phosphate; silk fibroin; repair; rabbits

1009-4237(2017)02-0114-04

国家自然科学基金青年基金(81401586)；全军十二五面上项目(CSY12J002)

110016 沈阳，沈阳军区总医院骨科(刘欣伟，赵勇，周大鹏，项良碧)，全军重症战创伤实验室(刘欣伟，柳云恩，张玉彪，侯明晓)

周大鹏，E-mail：me3210@163.com

R 683.41

A 【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.201.02.009

2016-02-01)