魏召新+朱世平+阳佳位

摘要：对柑橘不对称PCR的引物比例浓度进行优化筛选，并以不同柑橘品种的基因组片段为模板验证不对称PCR在柑橘品种基因型分析中的可行性。结果表明，不对称PCR双侧的引物最佳浓度因引物不同而不同，当浓度为10 ∶1时均能达到理想效果，可见不对称PCR可以用于柑橘基因型分析。

关键词：不对称PCR；单链构象多态性；柑橘；引物浓度比；基因型分析

中图分类号： S666.201 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0046-02

不对称PCR利用不等量的一对引物进行PCR扩增，产生单链产物（ssDNA），这对引物分别称为非限制性引物与限制性引物。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链产物。不对称PCR作为一个基础试验技术，方法简单、成本低廉、用途广泛，用于制备单链模板以用于双脱氧测序[1]，用于cDNA扩增以研究真核生物的DNA外显子[2]，用于单链探针制备[3]，还可与酶联免疫法结合检测柑橘CTV病毒[4]，甚至结合毛细管电泳技术对人进行疾病诊断[5]。

不对称PCR制备ssDNA须多次摸索优化2条引物的比例。常规不对称PCR是利用单侧引物进行一次PCR，然后进行电泳检测，这种方法要消耗大量的DNA模板。而二次PCR是先用等浓度的引物PCR扩增制备dsDNA，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第2次PCR，制备ssDNA，大大减少模板的消耗量，产生的dsDNA与ssDNA由于分子量不同可以在电泳中分开，并可利用单链构象多态性鉴别不同样品之间的差异。

利用不对称PCR进行基因差异分析，不仅具有PCR-SSCP研究单核苷酸多态性（SNP）的功能，而且简化了操作步骤，提高了工作效率。……