谭翰清 程洁萍 朱颖梅 谭海芳 黄强 苏乐斌 林凤 邓廷国 黎碧坚

526060 肇庆，广东省肇庆市疾病预防控制中心

·技术方法·

H5N6禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR的建立与应用

谭翰清 程洁萍 朱颖梅 谭海芳 黄强 苏乐斌 林凤 邓廷国 黎碧坚

526060 肇庆，广东省肇庆市疾病预防控制中心

目的 建立H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR，用于疑似病例快速诊断及活禽交易市场外环境监测。方法 根据GenBank 中H5N6禽流感病毒HA和NA高保守序列设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化双重实时荧光RT-PCR体系,进行特异性、灵敏度、重复性试验，并在临床应用中与商品化试剂盒比较。结果 H5N6双重实时荧光RT-PCR体系可在80 min内完成检测，与其它亚型流感病毒及常见呼吸道病原体无交叉反应，最低检测限达到10拷贝/反应，H5和N6靶基因标准曲线的相关系数R2分别为0.999和0.993，Ct值的变异系数分别为0.151%-0.549%和0.213%-0.575%，验证试验的阳性和阴性符合率均为100%。结论 H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR特异、灵敏、稳定,可在疑似病例的早期快速应急检测及活禽交易市场外环境持续性监测方面具有较好的应用价值。

Fund programs: Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province(A2015573);Zhaoqing Science and Technology Innovation Project(2015E1810)

自1997年首次发现人感染H5N1以来，H5亚型系列的禽流感病毒在不断进化、重组，已在禽类中发现H5N2、H5N5、H5N6、H5N8等亚型。近年监测数据发现，禽类及外环境中H5N6呈上升趋势[1-4]，广东、江西等地部分养殖场H5N6禽流感疫情[5]。2014年5月四川省发现了全球首个H5N6人感染病例，广东、云南等地也相继报告新的病例；活禽交易市场外环境中H5N6具有较高的污染率[6]。2015年12月肇庆市也发现1例H5N6病例，活禽交易市场外环境H5N6污染状况严重。

表1 H5N6禽流感病毒引物及TaqMan-MGB探针序列

注：H5引物、探针位置以KT245143序列为参考，N6引物、探针位置以KT313412序列为参考

Note:The position of primers and probes targed for the gene of H5 and N6 were refered to the sequences KT245143 and KT313412,respectively

H5N6在禽间的优势流行及人类感染病例的频密报告，给全球公共卫生敲响了警钟，需要加强对该病毒的快速诊断与持续监测。实时荧光RT-PCR具有快速、特异、灵敏的优势[7]，是新发和再发传染病应急检测与监测的重要工具。本研究拟建立H5N6禽流感TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR反应体系，用于疑似病例的快速诊断与活禽交易市场外环境持续性监测，为临床救治、疫情防控提供准确的病原学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 7500fast实时荧光PCR仪(美国ABI)、QIAxtractor核酸提取仪(德国Qiagen)、高速冷冻离心机(德国Hettich220)、凝胶成像系统(美国BioRad)等；QIAamp Viral RNA Mini Kit、QIAxtractor 病毒全自动核酸提取试剂盒、QIAprep Spin Miniprep Kit质粒提取试剂(德国Qiagen)，One-Step RT-PCR试剂盒(Abiom公司)。

1.2 引物和探针 根据GenBank公布的H5N6病毒HA和NA基因序列，通过NCBI的BLAST确定高保守区域，利用Primer-designer、Primer 5.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan-MGB探针的设计与评价，具体序列见表1。

1.3 核酸提取 咽拭子、外环境涂抹拭子需震荡混匀后3 000 rpm离心5 min，取140 μl上清液进行病毒RNA提取，大批量样本用QIAxctrator提取，小量标本用QIAamp Viral RNA Mini Kit手工提取，RNA -75℃保存备用，具体操作参照试剂盒说明书。

1.4 阳性标准品的制备 以肇庆市H5N6病例咽拭RNA为模板，进行H5和N6靶基因扩增，PCR产物纯化后连接至pUCK载体，并转化至感受态细胞，通过蓝白斑筛选、增菌后，进行阳性克隆质粒的抽提、纯化与鉴定，紫外分光光度计测值后稀释成1×109拷贝/μl，-20 ℃保存备用。

1.5 实时荧光RT-PCR初步建立与优化 根据One step RT-PCR Kit推荐的各组分浓度和循环参数，初步建立H5及N6一步法TaqMan-MGB探针单重及双重实时荧光RT-PCR反应体系，反应体积为25 μl。并根据引物、探针的溶解温度，调整和选择实时荧光RT-PCR反应的退火温度与时间，利用矩阵法优化引物和探针的最佳反应浓度。

1.6 实时荧光RT-PCR特异性试验 对H5N1、H5N2、H5N6、H6N6、H7N9、H9N2、H3N2、H1N1(2009)、Bv和By亚型流感、副流感、腺病毒3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等进行实时荧光RT-PCR，检测H5N6双重反应体系的特异性。

1.7 实时荧光RT-PCR灵敏度试验 取106-100拷贝/μl梯度的阳性质粒进行双重实时荧光RT-PCR，构建标准曲线和确定其最低检测下限。

1.8 重复性实验 取H5N63个浓度核酸各10份，-75℃保存，每天对各浓度样本进行双样检测，对10次反应的Ct值统计分析，计算各样品Ct值的平均值和变异系数，评价反应体系的重复性。

图1 H5N6实时荧光RT-PCR特异性(A)与灵敏度(B)试验Fig.1 Specificity and Sensitivity test of real-time RT-PCR for H5N6(A for specificity and B for sensitivity)

1.9 双重实时荧光RT-PCR临床标本验证试验 用经广东省疾病预防控制中心流感参比中心已确诊的肇庆市人感染H5N6病例咽拭、外环境监测阳性及阴性标本，对本研究建立的H5N6双重实时荧光RT-PCR进行验证试验，并与两种经省流感参比中心评估过的实时荧光PCR试剂盒进行比较，应用SPSS17.0进行两个样本率的卡方检验。

2 结果

2.1 阳性标准品的克隆与鉴定 H5和N6靶基因阳性克隆质粒PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，在85 bp、142 bp处有单一特异亮带；阳性克隆质粒靶基因片段所测到的序列经NCBI比对，与GenBank已公布的H5N6亚型中的HA(KT245143)和NA(KT313412)保守序列相一致。

2.2 双重实时荧光RT-PCR反应体系的优化 RT-PCR反应液体积20 μl，模板量加样量5 μl。经矩阵法优化，当反应体系中H5靶基因的引物和探针终浓度分别为0.4和0.2 μmol/L、N6靶基因的引物和探针终浓度分别为0.5和0.3 μmol/L时，可获得的双重反应扩增曲线效果最佳。ABI7500fast实时荧光PCR仪上反应循环参数为：45℃逆转录15 min；95℃灭活10 min；95℃变性10 s，56℃退火/延伸45 s(末端收集荧光)，45个循环。

2.3 反应体系特异性 双重实时荧光RT-PCR对H1N1(2009)、H3N2、H7N9、H9N2、Bv和By亚型流感、副流感病毒、腺病毒3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒均无扩增反应，对H5N1、H5N2仅有H5单重扩增，对H6N6仅有N6单重扩增，对H5N6具有典形“S”形双扩增曲线(图1A)。

2.4 灵敏度 H5N6双重实时荧光RT-PCR在109-101拷贝/μl的稀释梯度具有良好间隔的扩增曲线，最低检测下限能可达10拷贝数/反应 (图1B)。H5靶基因标准曲线相关系数R2为0.999，标准曲线斜率-3.354，截距43.128(图2A)；N6靶基因标准曲线相关系数R2为0.993，标准曲线斜率-3.362，截距43.657(图2B)。

2.5 重复性 对H5N6病毒3个不同核酸浓度样本(H、M、L)检测10次，H5靶基因的Ct值平均数分别为20.32、27.24、33.13，变异系数CV为0.151%-0.549%；N6靶基因的Ct值分别为21.02、28.01、33.24，变异系数CV为0.213%-0.575%。2.6 临床样本的验证性 对肇庆市首例人感染H5N6病例的3份阳性咽拭、外环境监测的28份阳性标本和180份阴性标本进行验证，H5N6双重实时荧光RT-PCR反应体系可对标本进行有效的区分，阳性扩增曲线呈典型S型，与两种主流的商品化H5N6核酸实时荧光PCR检测试剂阴阳性结果相一致。

3 讨论

图2 H5和N6亚型实时荧光定量RT-PCR标准曲线(A为H5、B为N6)Fig.2 Standard curve of real-time RT-PCR for H5 and N6 subtypes (A for H5 and B for N6)

H5N6为近年来新出现的高致病性禽流感亚型，自2014年5月四川发现了全球首例人感染H5N6病例，至2016年5月，我国共报告H5N6确诊病例13例、死亡6人，其中广东6例(肇庆1例)。研究者对H5N6禽源株和人感染毒株进行基因序列分析，发现其由H5N1和H6N6重组、进化而来[8，9]；2014年广州发现的人感染H5N6毒株HA及NA基因与2013年东莞养殖场中鸡分离株核酸同源性分别为99.4%和98.3%，内部基因同源性高达98.5%-100%，揭示了该病例所感染的H5N6禽流感病毒来源于禽类毒株[10]。鉴于当前H5N6在禽类间的广泛流行和对人致病的严重性，加强对该亚型禽流感的持续监测是十分必要的。

实时荧光RT-PCR可为禽流感病毒快速检测与监测发挥重要作用。周其伟等[11]应用TaqMan-LNA探针技术建立了H7N9实时荧光RT-PCR方法，刘婷婷等[12]应用TaqMan探针技术建立了H3N8实时荧光RT-PCR方法，均取得较好的效果。本研究通过对GenBank中H5N6亚型的HA和NA序列比对，发现不同毒株序列间难以找到高保守区进行TaqMan探针或分子信标探针较长片段的设计，而采用TaqMan-MGB探针技术，可使探针Tm值提高10℃左右且设计得更短[13]，极大地增加了引物、探针组合的可选性。经NCBI网站BLAST，本研究设计的H5N6双重引物和TaqMan-MGB探针均能特异地涵盖GeneBank已发布的H5N6序列，与其他流感病毒亚型和病原体序列不发生交叉反应，扩增曲线呈典型S型，最低检测下限可达10拷贝/反应，临床应用试验的阳性和阴性结果符合率100%，扩增效果与两种主要的商品试剂相一致。本研究建立的H5N6禽流感TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR可同时检测H5和N6靶基因，特异、灵敏地发现和鉴别临床疑似病例、外环境标本中的H5N6病毒，为临床救治、疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据，具有较好的推广应用前景。

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Development and application of dual real time RT-PCR for avian influenza H5N6 virus

TanHanqing,ChengJieping,ZhuYingmei,TanHaifang,HuangQiang,SuLebin,LinFeng,DengTingguo,LiBijian

ZhaoqingCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhaoqing526060,ChinaCorrespondingauthor:TanHanqing,Email:tanhanqing2000@163.com

Objective To establish a TaqMan-MGB probe-based real-time fluorescence RT-PCR assay for avian influenza H5N6 virus used in rapid diagnosis for suspected cases and surveillance for outer environment of live poultry markets. Methods Based on the conservative sequences of avian influenza H5N6 virus for HA and NA gene published on GenBank，specific primers and TaqMan-MGB probes were designed to develop and optimize for the dual real-time RT-PCR assay. Specificity, sensitivity, repeatability and comparison tests were carried out. Results This dual real-time RT-PCR detection can be completed within 80 minutes. There was no cross-reaction with other subtypes of influenza virus and common respiratory pathogens. The minimum detection limit could be up to 10 copies/reaction. The correlation coefficient of standard curve for the gene of H5 and N6 were 0.999 and 0.993,and the coefficients of variation for cycle threshold were range from 0.151%-0.549%and 0.213%-0.575%, respectively. The positive and negative coincidence rates of the validation test were 100%．Conclusions This TaqMan-MGB probe-based dual real-time RT-PCR for avian influenza H5N6 virus was rapid, specific and sensitive. It will have a good use in early emergency detection of suspected cases and continuous monitoring of external environment in live poultry trade market.

Avian influenza H5N6 virus；Real-time RT-PCR；TaqMan-MGB probe；Hemagglutinin gene；Neuraminidase gene

广东省医学科学技术研究基金(A2015573)；肇庆市科技创新计划项目(2015E1810)

谭翰清，Email:tanhanqing2000@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.013

H5N6禽流感病毒；实时荧光RT-PCR；TaqMan-MGB探针；血凝素基因；神经氨酸酶基因

2016-08-05)