王磊 金沛桦 瞿欢佳 蒋艳明 王洁 龚玲 陈公英 朱梦飞 施军平

310053 浙江中医药大学(王磊、金沛桦)；311121 杭州师范大学(瞿欢佳)；310011 杭州师范大学附属医院(蒋艳明、王洁、龚玲、陈公英、朱梦飞、施军平)

·病毒病诊断与治疗·

外周血可溶性sH2a在早期诊断肝纤维化程度中的价值

王磊 金沛桦 瞿欢佳 蒋艳明 王洁 龚玲 陈公英 朱梦飞 施军平

310053 浙江中医药大学(王磊、金沛桦)；311121 杭州师范大学(瞿欢佳)；310011 杭州师范大学附属医院(蒋艳明、王洁、龚玲、陈公英、朱梦飞、施军平)

目的 研究血清肝纤维化标志物sH2a用于诊断慢性肝病患者早期肝纤维化的临床诊断价值及意义。方法 收集67例行肝穿刺活检的慢性乙型肝炎、脂肪性肝病或两者合并患者作为研究对象，通过sH2a试剂盒检测外周血中可溶性sH2a的含量，与实验室指标及肝组织病理纤维化程度进行比较，并绘制特征曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)，分析其敏感性和特异性以评估该血清标志物对早期肝纤维化的诊断价值。结果 患者血清sH2a水平与肝脏纤维化程度呈负相关，且无纤维化(S0期)、早期纤维化(S1-S2期)和中晚期纤维化(S3-S4期)3组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。预测有无纤维化发生时，最佳诊断阈值为0.79，敏感性和特异性分别为63%、80%，AUC为0.772；评估有无明显纤维化发生时，当sH2a为0.77时，AUC为0.806，诊断灵敏度为85.7%，特异性为72.7%。结论 运用sH2a评估患者肝脏纤维化程度，可有效诊断患者肝脏早期纤维化，在区分有无明显纤维化上诊断价值更高，为临床诊断及治疗提供可靠依据。

Fund programs: Science and Technology Planning Project of Zhejiang Province of China(2013C33187,2014C37081);Medical and Health Science Foundation of Zhejiang Province(2011KYA132); Medical and Health Science Foundation of Hangzhou(2011KYA132)

多数研究认为肝纤维化是细胞外基质的合成与降解失衡，导致肝脏纤维结缔组织过度增生的结果[1]，作为各种慢性肝脏疾病的病理生理基础，亦是肝硬化和肝癌的早期阶段和必经阶段[2]。导致肝纤维化的病因种类繁多，如病毒、酒精、自身免疫、脂肪肝等，早期肝纤维化可逆，因此临床上早期诊断肝纤维化并进行动态监测显得尤为重要，影响疾病的长期预后。迄今为止，肝纤维化的诊断“金标准”仍是肝脏穿刺活检，但由于其有创性而难以常规开展[3]，临床上目前广泛应用的无创肝纤维化检测方法如肝区B超、肝组织弹性检测(FibroScan)、肝纤四联项等用于诊断肝纤维化时特异性和灵敏度方面均还存在一定的局限[4,5]，而采用无创模型精准诊断肝纤维化逐渐成为人们研究的热点。去唾液酸受体蛋白可溶性H2a亚基片段(Soluble from of H2a,sH2a)是人唾液酸蛋白受体(Human asialoglycoprotein receptor, ASGPR)的一个可溶性片段，它在肝细胞的内质网中被剪切，具有肝脏特异性。本研究旨在通过检测和比较肝纤维化不同病理分期患者外周血中sH2a水平，探讨sH2a对慢性肝病患者早期肝纤维化的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2013年01月至2013年12月期间杭州师范大学附属医院行肝穿刺活检并符合以下标准的患者共67例，其中男性49例、女性18例，平均年龄40.16±10.71岁，所有患者均签署知情同意书，研究获得杭州师范大学附属医院伦理委员会审查通过。入选的患者病种包括慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、非酒精性脂肪性肝病以及慢乙肝合并脂肪肝的患者，其中慢性乙型肝炎患者诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》[6]，非酒精性脂肪性肝病患者诊断符合《非酒精性脂肪性肝病诊断标准》[7]。同时排除①其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、药(毒)物性肝损伤、代谢性及遗传性肝病、晚期肝硬化有失代偿表现及肝脏肿瘤者；②合并人类免疫缺陷病毒、EB病毒等其他病毒感染者；③合并风湿免疫性疾病、代谢性疾病如系统性红斑狼疮、糖尿病、甲亢等；④合并有严重的心肺肾疾病，不能耐受肝穿刺术或有禁忌症者；⑤妊娠或哺乳期妇女。

1.2 资料收集 通过病史询问及人体学测量记录患者性别、年龄、病程、饮酒史、身高、体重，并计算体质指数(BMI)=体质量(kg)/身高(m2)。

1.3 实验室指标 所有纳入患者于肝穿刺术前1 d或当天清晨空腹采血送检，分离血清，-80℃冰箱保存，采用全自动生化分析仪(杭州师范大学附属医院检验科)检测以下相关指标：血清白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、血小板(PLT)。

1.4 肝组织穿刺活检 所有入选患者均在签署知情同意书后采用B超定位下局部麻醉经皮肝穿刺活检术，采用16G巴德一次性活检针(美国Bard公司)1 s快速穿刺活检术获取约0.8-1.0 cm长肝组织，用4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，制成连续切片，由同一位有经验的病理医生进行阅片，肝脏纤维化分期(S0-S4)诊断标准参考2000 年《病毒性肝炎防治指南》[8]。

1.5 血清肝纤维化标志物SH2a检测 本课题组和苏州和锐公司合作，采用纳米抗体制备技术，获得与B9抗体配对的单抗，构建较为稳定的双抗夹心ELISA方法，用于检测本项目外周血可溶性SH2a含量。

2 结果

2.1 3组患者基线特征及肝纤维化分期概况 根据入选标准和排除标准，本研究共纳入67例患者，其中男性49例、女性18例，年龄22-62岁，平均40.16±10.71岁。在肝纤维化分期上，根据病理学诊断分为3组：纤维化0期归为正常组，有6例(9.0%)；纤维化Ⅰ期和2期划分为早期肝纤维化组，以S1-S2期为主，共53例，约占79.1%；3期和4期患者划分为肝纤维化中晚期组，共8例(11.9%)；3组患者年龄、性别和体质指数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组患者基线特征比较

2．2 肝纤维化不同分期患者相关实验室指标比较S0期和S1-S2期患者实验室检测指标与 S3-S4期患者相比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

表2 肝纤维化不同分期患者相关血清学指标比较

2.3 血清sH2a水平与肝纤维化程度的相关性 S0期、S1-S2期患者血清sH2a含量均低于S3-S4期患者，且3组之间的差异有统计学意义(P=0.025<0.05)，Spearman等级相关性分析显示，sH2a值与肝脏病理纤维化分期呈负相关(r=-0.347，P=0.006<0.05)，见表3。

表3 肝纤维化不同分期sH2a水平比较

2.4 血清sH2a用于评估早期肝纤维化的准确性和价值 以S0期为阴性，S1-S4期为阳性标准，预判有无肝纤维化发生的准确性，绘制 ROC 曲线；以S0-S2为阴性，高于S2为阳性标准，预判有无明显肝纤维化的准确性，绘制S0-S2期与S3-S4期sH2a的ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)并进行分析见图1，具体数据见表4。

图1 预测有无纤维化指数的ROC曲线Fig.1 ROC curve on forecast of fibrosis having or not

组别Group最佳诊断阈值Cut-off敏感度(%)Sensitivity(%)特异性(%)Specificity(%)曲线下面积AUCPROC-10.7963.080.00.7720.048ROC-20.7785.772.70.8060.009

注：AUC=0.5时,无诊断价值；0.5

Note: AUC=0.5, no diagnostic value; 0.50.9 high accuracy

3 讨论

肝纤维化是疾病发展成为肝硬化的中间阶段。多种类型的慢性肝病均可以发展为肝纤维化[2]，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者，1.85亿人感染丙肝[9-11]，相当数量的上述肝病患者最终发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，严重威胁人类健康。肝纤维化病因十分复杂，目前研究认为肝细胞持续受到外界因素的损伤，随即释放炎症因子激活肝星状细胞，并使其分化为分泌细胞外基质的成纤维细胞和降解外界损伤的金属蛋白酶，分泌的细胞外基质和降解的成分沉积，加重肝纤维化，并逐渐导致肝硬化[12]。

肝纤维化病理上分为S1-S4期，S1-S2期肝纤维化可逆，多数患者确诊为肝纤维化时已经处于中晚期，早期诊断肝纤维化显得尤为重要。迄今为止，最可靠、最准确的诊断方法是肝穿刺活检，但由于其有创性、重复性低、价格昂贵等因素而受到诸多限制。目前临床上无创诊断肝纤维化的方法主要包括血清学指标和影像学检查两大类[13]。肝区B超为定性诊断，精度差，对诊断早期肝纤维化缺乏灵敏度；FibroScan是对肝组织弹性的量化分析，但对S1-S2期缺乏特异性，肥胖、腹水以及肝组织脂肪沉积时影响结果判断[14]。常用的肝纤四联项是一组血清蛋白指标，均属于细胞外基质蛋白或它们的降解产物，但主要问题是非肝脏特异性，肝外部位炎症活动可降低其清除率[15]，特异性和灵敏度均不理想。开发无创、高特异性和高灵敏度的早期肝纤维化诊断产品仍是临床上待解决的问题，对指导临床对肝纤维化的筛查、治疗疗效的监测及预后的评估有重要意义。

人唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 在体内仅在肝细胞中表达且负责唾液酸糖蛋白从血浆中清除，ASGPR由两个相关的氨基酸序列亚基H1(46KD)和H2(50KD)组成，H2a和H2b为ASGPR的H2亚基两个可变剪接体。研究显示，H2a在紧邻五肽处裂解为35 KD的片段，包括完整的胞外域，为分泌性的，组成受体的可溶形式(sH2a)。sH2a是一种仅在肝细胞表达的分泌型蛋白，分子量35 KD，在肝细胞的内质网中从45 KD的前体蛋白中剪切成35 KD的sH2a分泌到外周血中，是肝脏代谢的特异性标志物[16]。2004年以色列科学家发现该可溶性片段在正常人血清中含量稳定，但在丙肝引起的肝纤维化患者血清中sH2a的水平显著下降,并影响肝细胞功能[17]。

本研究分析杭州师范大学附属医院67例肝穿患者的血清sH2a水平与肝脏病理纤维化分期的相关性及诊断价值。本研究检测了血清总胆红素、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血小板等反应肝损害的相关实验室指标，3组之间差异无统计学意义(P>0.05)。在纤维化发生的早期，肝脏细胞处于修复代偿阶段，多数肝损伤标志物如肝酶指标尚维持在正常范围，无法发现早期的肝纤维化。研究结果显示，尚未发生纤维化的患者sH2a水平高于纤维化早期的患者，而纤维化早期患者的sH2a又明显高于中晚期纤维化组的患者，表明sH2a随着肝脏纤维化程度的不同也发生着动态变化，通过相关性分析得出与肝纤维化程度成负相关，随着慢性肝炎病程的进展而逐渐降低，尤其在晚期肝纤维化和肝硬化时降低最为显著，与其他各组比较均有统计学意义(P<0．05)；ROC曲线分析结果显示，预测有无肝纤维化发生时，最佳诊断阈值为0.79，此时的敏感性为63.0%、特异性达80%、AUC0.772(大于0.7)，诊断价值准确度中等；预测明显肝纤维化的发生时，最佳诊断阈值0.77、敏感性和特异性分别为85.7%和27.3%、AUC0.806(大于0.8)，诊断准确度佳。也就是说，当sH2a水平高于0.79时，可使72.7%的无或轻度肝纤维化患者避免“肝组织活检”，当界定值小于0.77时，可以诊断85.7%的患者显著性肝纤维化。因此，我们认为sH2a作为判断肝纤维化程度的指标，在肝纤维化早期sH2a即下降具有较好的灵敏度和特异性。

这是一个仍需要进一步研究的课题，本研究样本量有限，且纤维化分期为0期的及大于Ⅱ期的患者比例较低，在区别各个纤维化分期方面缺乏准确性，在今后的研究中应继续尽可能的扩大样本量。另外，无论是哪种类型的慢性肝病，都存在一定的个体差异，如年龄、肥胖、饮酒、HBV感染等因素，sH2a受不同因素影响是否会发生改变，如何改变等问题目前尚不清楚，sH2a具有肝脏特异性，但我们并不确定其在外周血的含量是否受其他疾病的影响，如肾脏疾病等，还应考虑指标对炎症活动度的反映，因为炎症始终是纤维化形成的重要因素，需要在今后的工作中累积更多的资料。

综上所述，sH2a与肝纤维化程度有良好的相关性，具有重复性强、简便等优点，可以诊断部分显著肝纤维化和进展性肝纤维化、肝硬化的排除，为各种肝病患者判断肝纤维化临床治疗效果提供可靠的指标，也为监测病情变化和评估药物疗效提供良好的动态观察指标，以达到代替或减少有创性肝活检的目的，值得广泛应用。

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The clinical diagnosis value and significance of serum sH2a level on early hepatic fibrosis degree

WangLei,JinPeihua,QuHuanjia,JiangYanming,WangJie,GongLing,ChenGongying,ZhuMengfei,ShiJunping

ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China(WangL，JinPH);HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310053,China(QuHJ);TheAffiliatedHospitalofHangzhouNormalUniversity,Hangzhou310053,China(JiangYM,WangJ,GongL,ChenGY,ZhuMF,ShiJP)Correspondingauthor:ShiJunping,Email:1395712119@vip.126.com

Objective We aimed, in our prospective study, to assess the predictive value of serum non-invasive and biochemical markers for clinical diagnosis of significant fibrosis (including early stages). Methods We measured sH2a levels in serum, comparing with routine liver function markers. We compared blindly pretreatment serum samples from a cohort of hepatitis B patients without non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD), which had histological grades of liver fibrosis, with NAFLD individuals and CHB with NAFLD patients. Statistical analysis was by Student′s t test, and receiver-operating characteristic (ROC) curves were drawn. Results ROC curves showed that serum sH2a had greater diagnostic performance than routine liver function markers compared with histological grades of liver fibrosis(S0,S1-2,S3-4). ROC curves showed that using a sH2a cut-off point of 0.79 was with highest sensitivity as 63% and highest specificity as 80%. And sensitivity as 96.7% and specificity as 75.5% when using a sH2a cut-off point of 0.77. Conclusions sH2a has the potential to be a uniquely sensitive and specific novel marker for liver fibrosis and function.

hepatitis cirrhosis;sH2a;serum level;liver tissue pathology

浙江省科技计划项目(2013C33187, 2014C37081)；浙江省医药卫生科技计划项目(2011KYA132)；杭州市医药卫生科技计划重大项目(2015ZD02)

施军平，Email:13957121199@vip.126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.012

肝纤维化；sH2a；肝病；血清学；肝组织病理

2016-05-03)