李伟 潘明 周兴余 林世华 刘学成 付士红 陈丹林 曹一欧 梁国栋 张佳珂

610041 成都，四川省疾病预防控制中心(李伟、潘明、周兴余、林世华、刘学成、陈丹林、曹一欧、张佳珂)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(付士红、梁国栋)

·论著·

四川省首株盖塔病毒SC1210的鉴定

李伟 潘明 周兴余 林世华 刘学成 付士红 陈丹林 曹一欧 梁国栋 张佳珂

610041 成都，四川省疾病预防控制中心(李伟、潘明、周兴余、林世华、刘学成、陈丹林、曹一欧、张佳珂)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(付士红、梁国栋)

李伟、潘明为并列第一作者

目的 对四川省从蚊虫分离到的病毒SC1210进行鉴定并分析其基因组特征。方法利用披膜病毒科甲病毒属特异性引物进行RT-PCR鉴定，并采用二代测序平台Ion Torrent PGM进行基因组全序列测定，然后利用Mega Align软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析，利用Mega 6软件绘制系统发生树。结果 SC1210为盖塔病毒(Getah virus,GETV)，该株病毒基因组全长11 690nt，与国内外其他分离株的核苷酸同源性为 99.2%-99.7%，氨基酸同源性为96.5%-99.4%。衣壳蛋白全长为804nt，编码268个氨基酸，与其他株的核苷酸同源性为94.9%-99.2%，氨基酸同源性97%-99.6%。E2基因全长1 266 nt，编码422个氨基酸，与其他株的核苷酸同源性为94.6%-99.6，氨基酸同源性为97.1%-99.5%。3′ UTR全长402 nt，具有GETV病毒独特的3个完整的重复序列元件和19 nt的保守序列。结论 四川省分离到的首株GETV SC1210与云南分离株YN0540亲缘关系较近，而与马来西亚原始株MM2021亲缘关系较远。

盖塔病毒(Getah virus,GETV)是披膜病毒科甲病毒属的成员，广泛分布于亚洲地区及澳大利亚北部的太平洋沿岸地区[1-5]，能在各种节肢动物和脊椎动物体内增殖[6]。该病毒可引起家畜发病，如马发热、荨麻疹和后肢水肿，并能引起猪的流产等，因此被确定为重要的动物源性病原体，在马来西亚、北澳大利亚和中国的人和鸟血清样本中均有检测到GETV病毒中和抗体[5,7,8]，提示该病毒也可能引起人类感染，但尚未有引起人类疾病的报道[9]。

GETV原型株MM2021是最早由美国陆军医学研究机构于1955年在马来西亚橡胶林中生存的白雪库蚊(Culexgelidus)中分离得到[10]。我国杨火等[11]于1964年在我国首次分离到了甲病毒属病毒M1株，但将此鉴定为GETV却经历了漫长的历程，并由此拉开了我国甲病毒属虫媒病毒监测和研究的序幕。在我国分离到第1株GETV M1株38年后，在2002-2012年，河北、云南、上海等10省市又陆续分离、鉴定了30余株GETV[12]，并进行了相关研究分析。

四川省在全省多地蚊虫标本中分离到乙脑病毒[13]，并在2008年从蚊虫标本中分离到Cat Que Virus[14]，均为我国的首次分离鉴定。2012年我们在洪雅县洪川镇采集的阿蚊标本中分离到SC1210病毒，并初步鉴定为甲病毒。为进一步了解该病毒的分子特征，追溯该病毒的可能来源及与国内外流行株的差异，进一步探讨其与其他甲病毒之间的关系，同时也为开展相关研究工作提供参考依据，本研究对四川省SC1210进行了全序列测定和分析，经比对为四川省首株GETV，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 蚊虫采集 2012年8月初在洪雅县洪川镇多个猪圈用紫外诱蚊灯采集蚊虫标本。诱蚊灯每天的采集时间段为19:00至次日7:00。捕获蚊虫在冰排上剔除雄性蚊虫并分类鉴定后，50-100只为一组放入2 ml冻存管，并液氮保存运输回实验室。1.2 病毒分离 将蚊虫标本倒入预冷的玻璃研磨器，加入1 ml细胞维持液(含有2 ml的谷氨酰胺、0.12%的NaHCO3以及100 U/ml的双抗)充分研磨后，将研磨液吸入1.5 ml预冷的EP管中，4℃条件下，12 000 r/min离心20 min。取上清液经0.22 μm无菌滤芯过滤后，分别取100 μl接种到生长至70%-80%的单层C6/36和BHK-21细胞进行病毒分离，连续3代出现规律细胞病变判为阳性。

1.3 分子生物学鉴定 利用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,Germany)试剂盒来提取病毒RNA，利用TaKaRa RT-PCR试剂盒进行逆转录获得cDNA，所有操作均按照试剂盒说明进行。应用部分常见虫媒病毒的属特异性引物进行PCR检测[4]。将PCR阳性产物在ABI3500-XL测序仪上进行一代测序，测序结果采用软件DNAStar 7.0进行碱基配对和校正。

1.4 基因组序列测定 基因组测序采用二代测序平台Ion Torrent PGM 进行。cDNA进行定量后，用Ion Xpress Plus Fragment Library kit 进行片段化和加接头，并用E-gel回收350 bp长的文库(插入片段长度200 bp)。文库稀释到合适的浓度后采用Ion PGM Template OT2 200 kit 进行油包水PCR。含有模板的微球颗粒上样到 Ion 318V2芯片上用Ion PGM sequencing 200 V2 kit进行PGM测序。PGM测序所有试剂均购自 Life technologies, Carlsbad, USA。二代测序的数据采用CLC genomics workbench 7.0.4软件进行分析。

1.5 数据分析 利用MegaAlign软件对所得序列及从GenBank中收集的相关序列(表1)进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析以及氨基酸位点改变分析，并在Mega 6软件中利用Neighbor-joining的算法进行进化分析。

2 结果

2.1 蚊虫标本采集数量及构成 2012年8月在四川省洪雅县洪川镇选择了3处猪圈和人房为蚊虫标本采集点，采集到包括三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)、阿蚊(Armigeressubalbatus)、中华按蚊(Anophelessinensis)在内的共计630只蚊虫标本，其中，以三带喙库蚊(300只)和阿蚊(280只)为优势蚊种，各占采集蚊虫标本的47.6%和44.4%。

2.2 病毒分离 将630只蚊虫标本分为18批进行研磨处理，分别接种C6/36和BHK-21细胞进行病毒分离。在连续传代过程中，1批标本能够同时引起C6/36和BHK-21细胞产生稳定的细胞病变，该株病毒(SC1210)接种BHK-21细胞后，24 h即可产生病变，表现为细胞圆缩；接种C6/36细胞后24 h左右产生病变，主要表现为细胞破碎。

2.3 病毒RNA提取、逆转录和PCR鉴定 吸取200 μl病毒培养液提取病毒RNA，利用TaKaRa RT-PCR试剂盒进行逆转录获得cDNA，利用随机六聚体引物逆转录获取病毒cDNA，首先使用乙脑特异性引物进行扩增，结果为阴性。然后分别使用甲病毒、黄病毒、版纳病毒和布尼亚病毒属特异性引物扩增，结果毒株SC1210为甲病毒属PCR阳性，其余全部为阴性。

表1 进化分析中所用的病毒株

2.4 病毒序列分析和系统进化分析

2.4.1 分子生物学鉴定: PCR扩增阳性产物经测序得到432 bp的目的条带，将所得序列与GenBank中已有的相应序列进行BLAST比对，结果显示SC1210与甲病毒属GETV同源性最近(96%-99%)，初步鉴定为GETV。

2.4.2 SC1210株病毒全序列分析:SC1210株为四川省分离到的首株GETV，故按上述所列方法对其进行了全序列测定。GETV基因组具有典型的甲病毒属基因组结构，分为两个独立的开放阅读框架(ORF)，5′ 端编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4，3′ 端编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。该株病毒基因组全长11 690 nt；衣壳蛋白全长为804 nt，编码268个氨基酸；E2基因全长1 266 nt，编码422个氨基酸；3′ UTR全长402 nt，具有GETV独特的3个完整的重复序列元件和19 nt的保守序列。

下载GenBank数据库中的分离于国内外不同地区不同时间的所有GETV全序列，与四川SC1210株及SAGV(Sagiyama virus)进行同源性分析。全序列同源性分析结果显示(表2)，SC1210与分离自日本的SAGV核苷酸同源性和氨基酸同源性皆为最低，分别为97.2%和96.5%；与2005年分离自中国云南的GETV YN0540核苷酸同源性和氨基酸同源性皆为最高，分别为99.7%和99.4%。已测全序的GETV中国分离株M1、SC1210、HB0234以及YN0540，核苷酸之间有超过97.9%的同源性，氨基酸之间有超过97.3%的同源性。

将包括SC1210在内的分离自国内外的共9株已测全序的GETV与马来西亚原始株GETV MM2021进行氨基酸差异分析，结果显示，经过不同时间的进化，各个分离株的编码结构蛋白区域的氨基酸都发生了一定程度的改变。C基因是编码病毒衣壳蛋白的基因，在本文研究的所有GETV中国株中，四川株SC1210除了与YN0540、HB0234共同的7个C蛋白氨基酸位点改变外，还在75位多了一个Q到K的改变。在E2区，基本都发生了10个以上位点的改变，其中SC1210、YN0540、HB0234以及韩国株、日本株、蒙古株都在第269位有一个共同的L到V的改变。此外，在E1区，国内分离株中，只有SC1210氨基酸位点改变最少，只有6处。E3区只有M1株在44位有一个P到S的改变，6K区只有SAGV在44位发生一个K到Q的改变。整体来看，虽然四川株SC1210分离年代间隔较GETV原始株MM2021比M1株更长，但是SC1210株所发生的结构蛋白区段氨基酸位点改变却比M1株少的多。

表2 GETV和SAGV全序列同源性分析

注：左下方为核苷酸序列同源性，右上方为氨基酸序列同源性

Note:The lower left is nucleotide sequence homology, the upper right is amino acid sequence homology

将包括GETV中国分离株SC1210、M1、HB0234、YN0540以及日本、韩国、俄罗斯、蒙古国分离株在内的15株甲病毒属病毒的全基因序列构建了系统进化树。因为马来西亚原始株GETV MM2021并未有全序可查，只有编码nsp1、E1 和3′ UTR的部分序列，故未将其列入全序列系统进化树的构建。据图1A所示，从全基因序列上来看系统进化关系，SAGV与其他GETV分属于同一个大分支，所有的GETV与RRV(罗斯河病毒)进化关系是最近的。2012年分离自四川的SC1210株与2005年分离自云南的 YN0540株进化关系比较近，其次是2002年分离自河北的HB0234株，与1964年分离自我国的M1株GETV亲缘关系较远。

注：▲为本研究所获得的序列

2.4.3 SC1210株衣壳蛋白基因核苷酸与氨基酸同源性及系统进化分析:衣壳蛋白基因是编码病毒衣壳蛋白的基因，对病毒颗粒的形成和存活至关重要[15]。选择国内外分离的10株GETV衣壳蛋白基因序列进行核苷酸与氨基酸序列的同源性分析，包括中国5株，韩国1株，蒙古、马来西亚、日本、俄罗斯各1株，毒株分离年代涵盖1955-2012年。结果显示，SC1210病毒衣壳蛋白基因与其他9株病毒核苷酸同源性为94.9%-99.2%，其中与马来西亚原始株MM2021的核苷酸同源性为94.9%，与韩国分离株的同源性为98.6%，与我国云南分离株的同源性最高，为99.2%。SC1210与其他9株GETV衣壳蛋白的氨基酸同源性为97%-99.6%，与MM2021同源性最低，为97%，与我国河北分离株、云南分离株、蒙古分离株以及韩国分离株均为99.6%。

为了解SC1210病毒衣壳蛋白与国内外分离的GETV病毒的进化关系，选择10株GETV病毒以及另外6株甲病毒属病毒进行系统进化分析，详见图1B。结果显示，分离年代相近的毒株，进化关系也相近，GETV病毒C基因系统进化分为两大支，马来西亚原始分离株与SAGV株以及俄罗斯分离株处于同一大分支，前两者处于同一小分支，亲缘关系更近。其他的7株病毒处于另外的大分支，SC1210与云南分离株YN0540处于同一分支中，亲缘关系最近。

2.4.4 SC1210株E2基因核苷酸与氨基酸同源性及系统进化分析: GETV E2基因具有很好的保守性，且中和位点位于E2基因。本研究选择国内外分离的15株GETV E2基因序列进行核苷酸和氨基酸的同源性分析，结果显示，SC1210与其他毒株的E2基因的核苷酸同源性为94.6%-99.6%，其与MM2021核苷酸同源性最低，为94.6%，与YN0540核苷酸同源性最高，为99.6%，其次为韩国分离株AY702913，为98.8%。SC1210与其他毒株E2基因的氨基酸同源性为97.1%-99.5%。其与MM2021同源性最低，为97.1%，与蒙古分离株、SH05-6、SH05-15、YN0540、YN0542分离株的氨基酸同源性最高，均为99.5%。

对15株病毒的E2基因进行了系统进化树分析后(图1C)，结果显示，E2基因进化分为两支，马来西亚原始分离株MM2021处于单独的一支，其他GETV处于另外的分支，SC1210株E2基因与云南分离株YN0540亲缘关系最近。

2.4.5 SC1210株3′UTR区序列同源性分析:甲病毒3′ 末端非翻译区(3′ UTR)是指从病毒基因组结构基因E1区终止密码子到Poly(A)尾的一段序列。所有甲病毒的这段序列中，都存在40 nt到60 nt的重复序列。不同的甲病毒3′ 非翻译区中重复序列的长度，碱基排列顺序以及重复序列的类型和数量等各不相同。而相同的甲病毒中则比较保守[16]。

SC1210株3′ UTR全长402 nt，具有GETV病毒独特的3个完整的重复序列元件(RSE)和19 nt的保守序列。研究发现，中国分离株(M1、GS10-2、HB0215-3、HB0234、SH05-6、SH05-15、SH05-16、SH05-17、YN0542)在RSE之前的45-54位都有10个核苷酸的缺失，仅SC1210株与云南分离株YN0540只有9个核苷酸的缺失，在第45位都多了一个T，具有较为特殊的结构特征。

选择国内外于不同时期分离的16株GETV进行3′ UTR区核苷酸的同源性分析，SC1210株与其他株的核苷酸同源性为79%-99.5%，与韩国分离株AY702913同源性最低，为79%，与云南分离株YN0540为99.5%。韩国分离株与其他分离株的3′ UTR区同源性最低，其核苷酸同源性为72.5%-79.6%。

3 讨论

GETV是我国分离最早的甲病毒，于1964年在海南首次分离得到。此后，近40年的时间，我国都再未监测和分离到GETV，直到38年后的2002年，河北省的再次分离和鉴定，才真正拉开了对GETV全面认识的序幕[17,18]。到目前为止，我国大陆有10个省市报道了30株在蚊子标本中分离到的GETV[12]，病毒的分离地点跨越了我国的南北地域(从北纬19°的海南省到40°23′ 的河北省)，同时又比较集中在2002年以后，表明GETV至少在2002年后在我国广泛分布。本研究所鉴定的SC1210病毒，为四川省首次分离到的GETV。SC1210病毒的分离提示GETV在四川省的蚊虫媒介中可能广泛存在，具有潜在的感染人或牲畜的可能性，下一步应采集本省的人和牲畜血清标本进行抗体筛查，了解省内人和牲畜体内是否存在甲病毒隐性感染，并深入探讨SC1210 GETV是否对人畜具有致病意义。

对甲病毒属的几种病毒进行全序列系统进化分析后发现，日本发现的SAGV在马中可引起与GETV相同的临床症状，与GETV关系密切，与其他GETV在进化关系上属于同一分支，而其他的甲病毒属成员则位于另外的分支，这也从另一个侧面印证了有些学者的理论，认为SAGV是GETV的一种亚型[6]。中国2002年后分离到的GETV与1964年分离到的M1株位于不同的进化分支，进化关系较远，提示近年来在中国流行的GETV较38年前发生了一定程度的进化。但2000年分离的俄国、蒙古国株是个特例，并未与其分离年代相似的分离株亲缘关系更近，而是与中国1964年分离株M1、1956年日本分离株SAGV亲缘关系更近，也从侧面表明，俄国、蒙古国GETV分离株在36年间的进化可能是较缓慢的。

SC1210病毒的衣壳蛋白和E蛋白与马来西亚GETV原始分离株MM2021以及中国1964年的分离株M1相比，位于GETV的不同分支中，亲缘关系较远，由此可见，分离年代越相近则病毒进化距离越近，这与陈维欣等[19]在山东省以及Wekesa等[20]在日本研究GETV时得出的结论一致。同时，SC1210病毒与云南分离株YN0540的衣壳蛋白和E蛋白的同源性最高，且系统进化始终处于同一分支，亲缘关系最近，因为云南与四川接壤，地理环境相似，所以GETV的进化可能与地理环境有关。

所有的中国分离株在 3′ UTR中45-54位都存在10 nt的缺失，唯独SC1210与YN0540只有9 nt的缺失。韩国分离株AY702913的3′ UTR区与其他国家的分离株相比，核苷酸和氨基酸同源性较低，存在较大的差异。除了韩国分离株分离自猪血清外，其他分离株均分离自蚊子，而且同源性较高、亲缘关系最近的SC1210与YN0540都分离自阿蚊，所以，3′ UTR区的较大差异与病毒来源是否有关还需要进一步的探讨研究。

四川省地理景观多样，气候温和，适合多种媒介昆虫生长和其体内的病毒繁殖，四川省自2004年起，开始了较为系统的虫媒病毒调查研究[21]，并相继在蚊虫标本中分离到乙脑病毒、Cat Que 病毒和GETV，由此可见，四川省存在多种虫媒病毒，其中Cat Que 病毒和GETV与人类疾病之间的相互关系还需进行深入详尽的研究。

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First isolation and identification of Getah virus SC1210 in Sichuan

LiWei,PanMing,ZhouXingyu,LinShihua,LiuXuecheng,FuShihong,ChenDanlin,CaoYiou,LiangGuodong,ZhangJiakeSichuanCenterforDiseaseControlandPrevention,Chengdu610041,China

(LiW,PanM,ZhouXY,LinSH,LiuXC,ChenDL,CaoYO,ZhangJK);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(FuSH,LiangGD)

LiWeiandPanmingarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

ZhangJiake，Email:scszjk@163.com

Objective To study the genome molecular characteristics of Getah virus (SC1210) which isolated in Sichuan province in 2012. Methods Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to identify the isolate and the genome was sequenced by the second Ion Torrent PGM. Computer softwares, including Mega Align and Mega 6, were used to analyze the nucleotide and deduced amino acid sequence, and draw phylogenetic trees. Results SC1210 was identified as Getah virus. The full genome sequence was 11 690nt, the nucleotide and amino acid homology of the full sequence with other strains were 99.2%-99.7% and 96.5%-99.4%.The capsid protein of SC1210 consisting of 804 nucleotides, encoding 268 amino acids and the full-length of E2 protein, had 1 266 nucleotides, encoding 422 amino acids. The nucleotide homology of the capsid protein and the E2 protein with other strains were 94.9%-99.2% and 94.6%-99.6%, and the amino acid were 97%-99.6% and 97.1%-99.5%. The 3′ UTR of the virus included 402 nucleotides and there were three repeat sequence elements and 19 nucleotides conservation sequence. Conclusions The first GETV isolate SC1210 in Sichuan province has a closer relationship with Yunnan strain YN040 and a far genetic relationship with MM2021.

Getah virus; Capsid gene; E2 protein gene; 3′ untranslated region; Nucleotide sequence

张佳珂，Email: scszjk@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.001

盖塔病毒；衣壳蛋白基因；E2蛋白基因；3′ 非翻译区；核苷酸序列

2015-08-21)