刘存弟, 林大杰



基于新型纳米团簇荧光共振能量转移体系的构建及其在葡萄糖检测中的应用

刘存弟, 林大杰

（温州大学 化学与材料工程学院，浙江 温州 325035）

通过合成生物兼容性优异的新型纳米团簇，如碳、铜纳米团簇，并构建了荧光共振能量转移（FRET）体系，以此来对葡萄糖进行高灵敏、高选择性的检测。通过荧光光谱分析仪、透射电子显微镜和红外光谱等进行表征。在最优条件下，系统荧光强度随葡萄糖浓度的增加呈线性增强，线性范围是9 ~54 μM，检测限是6.39 μM。该探针具有较高的灵敏度和选择性。

关荧光；葡萄糖；碳量子点；铜纳米簇

在自然界中众多的生物化合物中，葡萄糖是我们日常生活中比较重要的物质之一。而且糖尿病也与葡萄糖有着密切的联系。人体血糖浓度与正常值的比较是判断高血糖症状的标准，正常的血糖浓度范围有两种情况，一种是空腹（3.9~6.2 mM），另一种是饭后2 h（3.9~7.8 mM）。糖尿病还可以引起一些其他疾病，比如肾衰竭、心脏病和失明[1, 2]。因此，葡萄糖的定量检测在很多领域都具有非常重要的意义，包括从生物医学应用到生态方面等诸多领域[3]。因此，不管是医学上还是科研领域都迫切需要对葡萄糖的检测方法进行研究。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

实验中所用的溶剂全部为超纯水Milli-Q(≧18 MΩ)，是由超纯水系统(Millipore, Biocel)制备的。用到的所有试剂有苯硼酸、苯硼酸、二水合氯化铜、硼氢化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、3-巯基-1，2-丙二醇、葡萄糖蔗糖、D-(+)-半乳糖、D-果糖、麦芽糖、β-乳糖均购于上海阿拉丁试剂有限公司。

主要仪器有F-7000荧光光谱仪（日本日立公司），Avatar 360红外分光光谱仪（美国尼高力仪器公司），JEM-2100F透射电子显微镜TEM（日本电子），SES 2002 X射线光电子能谱仪XPS(日本岛津公司)。

1.2 纳米材料的合成及功能化

1.2.1 硼酸功能化的碳量子点(C-dots)的合成

根据文献用苯硼酸一步自身还原合成碳量子点的方法[4]，将0.2 g苯硼酸溶于20 mL去离子水中，室温搅拌10 min，然后逐滴搅拌加入NaOH溶液使pH=9，当溶液变得澄清后全部转移到反应釜内胆中，放入烘箱中160 ℃自身还原8 h，然后冷却至室温，用超滤管在10 000 r/min下离心20 min除去未反应的苯硼酸，再用去离子水清洗2~3次，在超滤管的底部得到了硼酸功能化的碳量子点(C-dots)，保存在-4 ℃的冰箱中待用。

1.2.2 3-巯基-1，2-丙二醇(MG)功能化的铜纳米簇（CuNCs）的合成[5]

0.037 g无水氯化铜溶于20 mL去离子水中，加入过量的3-巯基-1，2-丙二醇做保护剂，室温搅拌5 min，形成黄色凝胶溶液，然后逐滴搅拌加入NaOH溶液使溶液变澄清，约10 min后加入适量新配制的硼氢化钠溶液作为还原剂还原铜盐，然后将溶液全部转移到反应釜中内胆中，放入烘箱中120℃反应5 h，然后冷却至室温，用超滤管在10 000 r/min下离心20 min除去未反应的保护剂和多余的氢氧化钠，再用去离子水清洗2~3次，在超滤管的底部得到了3-巯基-1，2-丙二醇功能化的铜纳米簇（CuNCs），保存在-4 ℃的冰箱中待用[6]。

2 性能与表征

2.1 硼酸功能化的碳点(C-dots)的表征

2.1.1 透射电子显微镜（TEM）

通过透射电子显微镜（TEM）来观察C-dots的形貌特征和尺寸大小。如图1所示，a图是所合成的碳量子点的整体分散情况，分布很均匀，形貌为球形，直径大小范围从2.5 nm到4.5 nm，平均直径大约是4 nm左右；b图是碳量子点局部放大图，可以看到纳米材料的晶格常数是0.23 nm；c图是碳量子点中加入铜纳米簇后发生荧光共振能量转移的透射电镜图，由于铜纳米簇的加入拉近了碳量子点之间的距离，图中看出材料之间发生了团聚；d图是在c图的基础上再加入葡萄糖破坏了荧光共振能量转移体系，碳量子点之间的距离加大，团聚现象也随之减弱。

图1 透射电镜图（TEM）

（a）碳量子点整体图；（b）碳量子点局部图；（c）向碳量子点中加入铜纳米簇发生荧光共振能量转移；（d）向c中加入葡萄糖

2.2 实验机理

本实验基于纳米材料之间可以建立荧光共振能量转移（FRET）体系的原理，建立了一种铜纳米簇（CuNCs）猝灭碳量子点(C-dots)的新型纳米荧光探针实现对葡萄糖定量检测的新方法。碳量子点(C-dots)具有良好的光学性质及高的量子产率，因此可以作为FRET体系中一种理想的供体；同时，由于铜纳米簇（CuNCs）具有高的消光系数，可以作为FRET中一种良好的荧光猝灭剂。根据硼酸键与邻二醇可以可逆结合的原理，将3-巯基-1，2-丙二醇功能化的铜纳米簇（CuNCs）靠近硼酸功能化的碳量子点（C-dots）并且达到了FRET发生的距离范围之内，从而产生了高效率的FRET。将一定量的碳量子点（C-dots）和不同浓度的铜纳米簇（CuNCs）混合特异性结合发生能量共振转移，使碳量子点荧光猝灭，找到适合测定葡萄糖浓度的平台，当葡萄糖存在时，葡萄糖与巯基甘油竞争同硼酸的结合位点，使得FRET的效率降低，在一定可控范围里表现为荧光峰发射位置不变而吸收强度变化，随葡萄糖浓度的增加碳量子点（C-dots）的荧光强度逐渐恢复。从而可通过对荧光峰的强度变化的分析定量测定葡萄糖的浓度，实现葡萄糖的高选择性检测。

2.3 传感器性能测试

2.3.1 荧光共振能量转移(FRET)体系的构建

根据之前的实验步骤在20 μL碳量子点中加100 μL PBS (pH=7.4，0.2M)和不同量的3-巯基-1，2-丙二醇功能化的铜纳米簇(0、20、60、100、140、180、220、260、100 μL)，然后用去离子水均稀释至1 mL，室温孵化半小时，以碳量子点的荧光为荧光源来测荧光，如图2所示，随着铜纳米簇加入的量的增加，荧光强度逐渐降低，当铜纳米簇的量为260 μL和300 μL时荧光强度几乎重合，不能再降低，故选择铜纳米簇300 μL作为测定葡萄糖的平台。

图2 不同体积的铜纳米簇（CuNCs）对FRET体系荧光强度的影响

2.3.2 定量测定葡萄糖

根据之前选出的测定葡萄糖的平台构建葡萄糖荧光传感器，由图3所示，在所构建的荧光共振能量转移体系的基础上分别加入不同浓度的葡萄糖(0、9、18、27、36、54 μM)，然后均用去离子水稀释至1.3 mL，室温孵化60 min后测荧光。

(a)图中显示，随着葡萄糖浓度的增加荧光强度也随着增强，但是幅度不是很大，因为葡萄糖与苯硼酸的结合能力大于3-巯基-1，2-丙二醇功能化的铜纳米簇，故通过竞争反应使C-dots与CuNCs的距离变大，不满足FRET的发生所需要的条件，C-dots荧光恢复，但还有部分CuNCs与C-dots结合，所以荧光不能全部恢复。

(b)图是在完全相同的条件下进行了三次实验所得到的测定葡萄糖的校准图，图中展现了荧光强度与葡萄糖浓度在范围9~54 μM内有很好的线性关系，线性回归方程是=2.11×Cglucose(μM)+232.02，相关系数是2=0.988。根据LOD=3/的比值（是被测分析物浓度最小时的背景信号标准偏差，是目标分析物浓度与荧光强度间线性关系式的斜率），可以推算出本实验设计的传感器的检测限为6.39 μM。

图3 应用本实验所设计的方法在荧光共振能量转移体系中监测葡萄糖(0、9 、18 、27、36、54 μM)

2.4 传感器选择性测试

本文论述的生物传感器加入其他干扰糖类，如果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖和β-乳糖，监测产生的荧光强度恢复程度。36 μM的各种糖类及葡萄糖分别加入相同条件下构建的生物传感器中。

图4 生物传感器的选择性（葡萄糖和其他糖类的浓度均是36 μM）

如图4所示，其他干扰糖类在相同浓度下对生物传感器的荧光强度恢复甚微，只有葡萄糖和麦芽糖对生物传感器荧光强度有一定的恢复，说明生物传感器对葡萄糖有一定的选择性，而麦芽糖在水溶液中会水解生成葡萄糖，故对本实验的传感器也有一定的响应。由此可得出的结论是本文论述的荧光生物传感器对葡萄糖有较强的选择性。

3 结果与讨论

本章实验制备的荧光葡萄糖传感器结合了纳米材料之间的荧光共振能量转移(FRET)技术和硼酸酯键与邻二醇的特异性可逆结合以及葡萄糖的竞争反应。该方法展示了比较宽的检测范围和比较好的检出限。此外，本文论述的传感器根据其他的二塘类或者多糖类的水解产生葡萄糖相互作用，可用于定量检测其他二塘类或者多糖类生物分子。

[1] Li Y, Zhong Y, Zhang Y, et al. Carbon quantum dots/octahedral Cu 2 O nanocomposites for non-enzymatic glucose and hydrogen peroxide amperometric sensor[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2015, 206(3): 735-743.

[2] 吴忠玉, 方浩, 徐文方. 基于有机硼酸的葡萄糖荧光传感器的研究进展[J]. 有机化学, 2007, 27(7): 830-836.

[3] Chen Z, Li Q, Wang X, et al. Potent method for the simultaneous determination of glutathione and hydrogen peroxide in mitochondrial compartments of apoptotic cells with microchip electrophoresis-laser induced fluorescence[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(5): 2006-2012.

[4] Shen P, Xia Y. Synthesis-modification integration: one-step fabrication of boronic acid functionalized carbon dots for fluorescent blood sugar sensing[J]. Anal Chem, 2014, 86(11): 5323-5329.

[5] 余明明, 刘东志, 李巍, 等. 巯基丙酸保护的纳米银制备及热分解行为研究[J]. 化学工业与工程, 2015, 32(6).

[6] Tang Y, Yang Q, Wu T, et al. Fluorescence enhancement of cadmium selenide quantum dots assembled on silver nanoparticles and its application to glucose detection[J]. Langmuir, 2014, 30(22): 6324-6330.

Construction of Fluorescence Resonance Energy Transfer System Based on Novel Nanoclusters and Its Application in Glucose Detection

,

（Wenzhou University, Zhejiang Wenzhou 325035，China）

A new type of nano clusters with excellent biocompatibility was synthesized, such as carbon, copper nanoclusters;and the fluorescence resonance energy transfer (FRET) system was constructed in order to detect glucose. The system was characterized by fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy and infrared spectroscopy. The results show that, under optimized experimental conditions, the fluorescence intensity increases linearly with the increase of glucose concentration in the range of 9 ~54 μM, and the detection limit is 9 μM. The probe has high sensitivity and selectivity.

fluorescence; glucose; C-dots; CuNCs

2016-03-20

刘存弟（1989-），女，硕士，山西省忻州市人，2017年毕业于温州大学化学专业，研究方向：分析化学。

林大杰（1978-），男，副教授，博士，研究方向：分析化学。

TQ 028

A

1004-0935（2017）05-0423-03