申定珠邢三丽 陈 川吴蓓玲 迟惠英 陈久林

（上海市中医老年医学研究所，上海 200031）

·研究报告·

基于ApoE-/-小鼠TLR4、MCP-1、ICAM-1表达探讨首参颗粒干预动脉粥样硬化的效应机制*

申定珠△邢三丽 陈 川△吴蓓玲 迟惠英 陈久林

（上海市中医老年医学研究所，上海 200031）

目的 观察首参颗粒对ApoE-/-小鼠Toll样受体4（TLR4）、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的影响。方法 采用高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠复制动脉粥样硬化（AS）模型，并给予首参颗粒、阿托伐他汀干预15周，采用Western blotting法检测小鼠主动脉TLR4蛋白表达，ELISA法检测血清MCP-1、ICAM-1表达，结合血脂及组织病理学检测。结果 与正常组比较，高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠可致明显的AS病变，TLR4、MCP-1、ICAM-1表达上调及TC、LDL-C含量升高；经首参颗粒干预，AS斑块面积显著减小，TLR4、MCP-1、ICAM-1表达下调，TC、LDL-C含量降低（P＜0.05或P＜0.01）。结论 首参颗粒可通过下调ApoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达与血清MCP-1、ICAM-1水平进而有效干预治疗AS。

动脉粥样硬化 TLR4 MCP-1 ICAM-1 首参颗粒

动脉粥样硬化（AS）主要发生于中老年人，与增龄、衰老进程密切相关［1］。随着人口老龄化的加剧，AS导致的心脑血管疾病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势［2］。我们前期研究提示，补肾中药复方首参颗粒可有效干预治疗AS［3-5］。国内外研究表明，Toll样受体（TLRs）尤其是Toll样受体4（TLR4）与AS关系紧密，在AS进程中起重要作用［6］。本研究以ApoE-/-小鼠模型为研究对象，应用Western blotting法分析小鼠主动脉Toll样受体4（TLR4）的蛋白表达，ELISA法检测小鼠血清单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达，结合主动脉组织病理学观测及血脂检测，以期进一步揭示首参颗粒干预治疗AS的作用机制，为从补肾治疗AS相关疾病提供更加客观的实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性12周龄ApoE-/-小鼠，SPF级，体质量（20±5）g，购自上海南方模式生物研究中心，许可证号为SCXK（沪）2009-0023；同品系、同周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量（20±5）g，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXX（京）2012-0001。于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房单笼喂饲、造模及观察。

1.2 药物与试剂 首参颗粒由制首乌15 g，枸杞子15 g，生山楂10 g，参三七3 g组成，为颗粒剂型（6.2 g/袋，江阴天江药业有限公司生产）；阿托伐他汀片（10 mg/片，辉瑞制药有限公司生产）。主要试剂：小鼠抗TLR4单克隆抗体购自Acris公司；小鼠抗GAPDH购自上海康成生物工程公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；ELISA试剂盒 （MCP-1、ICAM-1）为Abcam公司产品。总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 造模与分组 12周龄雄性ApoE-/-小鼠36只，予普通小鼠饲料适应性喂养1周后，随机分为3组：ApoE-/-小鼠＋高脂饮食模型对照组 （模型组，n=12）、ApoE-/-小鼠＋高脂饮食＋中药组（中药组，n=12）、ApoE-/-小鼠＋高脂饮食＋西药组（西药组，n=12）；同周龄、同品系C57BL/6J小鼠作为正常对照组 （正常组，n=12）。高脂饮食配方为21%脂肪+0.5%胆固醇+小鼠常规基础饲料。中药组、西药组分别予首参颗粒、阿托伐他汀灌胃（60 kg成人体质量的等效剂量），正常组灌胃等体积0.9%氯化钠注射液，每日1次，用药至15周末。

1.4 检测指标 HE染色观测小鼠主动脉组织病理形态。于10%甲醛固定的主动脉，切取距主动脉根部0.5 cm处的主动脉弓，常规脱水，石蜡包埋，从主动脉根部起始连续切片（5 μm），行HE染色，光学显微镜下观察其病理形态。血脂检测TC、TG、HDL-C、LDL-C，按照试剂盒说明书操作。ELISA法检测小鼠血清MCP-1、ICAM-1表达。小鼠摘眼球取血，静置4～6 h，3000 r/min离心30 min，小心吸取上层血清。按ELISA试剂盒方法操作，即刻测量标本OD450值，根据说明书绘制标准曲线，并根据标准曲线查找对应的浓度范围。Western blotting法检测小鼠主动脉TLR4蛋白表达。主动脉总蛋白提取，BCA法蛋白定量→12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离→PVDF转膜→牛血清白蛋白封闭→加入一抗工作液 （TLR4 1∶1000）→4℃孵育过夜→洗膜→加入辣根过氧化物酶HRP标记二抗→化学发光法显影，拍照分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间差异比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠主动脉组织病理形态学观察 见图1。结果显示，高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠15周后，主动脉根部观察到大面积AS斑块；较之模型组，中药组、西药组AS斑块面积显著减小（P＜0.05）；中药组、西药组AS斑块面积组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组小鼠主动脉HE染色结果

2.2 各组小鼠血脂检测结果 见表1。结果显示，高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠15周后，血清TC、LDL-C含量明显升高（P＜0.01）；较之模型组，中药组、西药组TC、LDL-C含量明显降低（P＜0.05）；中药组、西药组TC、LDL-C组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组血脂检测结果比较（mmol/L，±s）

表1 两组血脂检测结果比较（mmol/L，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.3 ELISA法检测各组小鼠血清MCP-1、ICAM-1表达 见表2和图2。结果显示，高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠15周后，血清MCP-1、ICAM-1表达显著升高（P＜0.01）；较之模型组，中药组、西药组MCP-1、ICAM-1表达显著降低（P＜0.05或P＜0.01），中药组、西药组MCP-1、ICAM-1组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 Western blotting法检测各组小鼠主动脉TLR4蛋白表达 见图3。结果显示，高脂饮食喂饲ApoE-/-小鼠15周后，主动脉TLR4蛋白表达增高；较之模型组，中药组、西药组小鼠主动脉TLR4蛋白表达降低。

表2 两组ELISA法检测MCP-1、ICAM-1表达比较（ng/mL，±s）

表2 两组ELISA法检测MCP-1、ICAM-1表达比较（ng/mL，±s）

组别 n MCP-1 ICAM-1正常组 6模型组 6中药组 6 18.95±6.23 7.53±1.62 40.06±7.25△△16.35±3.49△△26.69±7.02*10.32±2.91*西药组 624.37±10.56**11.66±2.65*

图2 ELISA法检测MCP-1、ICAM-1表达柱状图

图3 Western blotting法检测小鼠主动脉TLR4蛋白表达

3 讨 论

ApoE基因敲除小鼠是应用胚胎干细胞基因敲除技术培育而成［7］。因其具有自然发生、渐进发展、病理形态典型的特点，发病过程最接近自然状态下人体AS发病情况，被公认是目前研究AS病理过程及药物干预的理想模型。即使在普通饮食喂养条件下该模型仍可自发形成高胆固醇血症和AS［8］，但由于其周期较长往往不便于实验，而高脂饮食会加速小鼠AS形成。因此，本实验采用高脂饲料喂饲雄性ApoE-/-小鼠15周的方式建立AS动物模型，主动脉病理提示形成典型的AS斑块，血脂检测提示血清TC、LDL-C含量明显升高。

AS是心、脑血管事件发生的共同病理基础，伴有免疫反应的炎症过程贯穿于AS始终［9］。TLRs作为介导天然免疫与炎症反应的主要模式识别受体，在AS中所发挥的作用愈发受到重视［10］。目前已知人类TLRs家族成员12名，其中以TLR4与AS关系最为紧密。TLR4表达于AS血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、外膜成纤维细胞及树突状细胞，尤其在血管内皮细胞与AS斑块中高表达［11］。既往研究表明，ApoE-/-小鼠TLR4通路相关基因表达及AS的发生率、发生程度明显高于同品系C57BL/6J小鼠［12］。TLR4活化在免疫、炎症信号转导中扮演重要角色，它可通过MyD88依赖性信号转导途径激活转录因子NF-κB，启动AS血管平滑肌、内皮细胞、斑块中MCP-1、ICAM-1等多种炎性因子的转录和合成［13］；TLR4活化还可促进巨噬细胞向泡沫细胞的分化［14］，阻断巨噬细胞和动脉组织中肝X受体途径而抑制巨噬细胞中胆固醇的外流，促进AS斑块发生［15］。笔者采用Western blotting法检测了小鼠主动脉TLR4的蛋白表达，发现高脂饮食可诱导ApoE-/-小鼠主动脉TLR4的蛋白表达。

MCP-1又称“前炎性因子”，由单核细胞或巨噬细胞分泌，并对单核巨噬细胞有趋化、激活作用，可使各种炎性细胞特别是单核细胞向病变部位聚集，并对炎症因子的刺激做出应答。同时，它还能活化白细胞并介导其产生炎性介质，诱导斑块处内皮细胞移行、平滑肌细胞分裂、增生及血栓斑块形成［16］。ICAM-1为免疫球蛋白超家族一员，是黏附分子家族的重要成员，主要表达于血管内皮细胞、上皮细胞及白细胞。ICAM-1在活性内皮细胞上的表达是循环白细胞聚集浸润引起一定部位组织损伤和炎症反应的关键，抑制ICAM-1的表达可减少AS形成过程中炎症细胞的聚集及其炎症细胞与内皮细胞的黏附，延缓AS的进程［17］。笔者采用ELISA法检测了血清MCP-1、ICAM-1的表达，实验结果表明，高脂饮食可诱导ApoE-/-小鼠血清MCP-1、ICAM-1的表达显著升高。

基于AS本虚标实的病机特点，课题组自上世纪80年代以来，将AS与衰老及衰老相关退行性疾病的发生发展有机联系，通过对补肾中药治疗AS的系统研究发现，补肾中药复方在明显改善衰老症状、功能的同时还具有显著的抗AS作用［18］。为此，我们从补肾立论，创立了补肾中药复方首参颗粒，该方由制首乌、枸杞子、生山楂、参三七组成，诸药合用，共奏补肾益精、活血通络之功。前期动物实验表明，首参颗粒对AS模型大鼠整体状况、主动脉组织学均有显著的干预治疗作用，可降低血脂对内皮的损伤、减少炎症因子攻击、抗氧化应激损伤，延缓血管老化，从而抑制AS的发生和发展［19］。在此基础上，进一步临床试验提示首参颗粒可降低颈动脉粥样硬化（CAS）患者TC、LDL-C含量，降低白细胞介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）表达［3-4］，降低臂踝脉搏波传导速度（baPWV）及颈动脉内中膜厚度（CIMT），增强颈动脉血管弹性［5］。

本文研究结果表明，高脂饮食可成功诱导ApoE-/-小鼠主动脉AS形成及高脂血症。首参颗粒可明显减轻高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS病变，降低TC、LDL-C含量，下调TLR4、MCP-1、ICAM-1表达。由此提示，首参颗粒可有效抑制TLR4的蛋白表达，降低炎症因子MCP-1、ICAM-1表达，降低血脂含量，调控免疫及炎症反应，减少内皮损伤和泡沫细胞形成，这可能是其抗AS的关键作用机制之一。后续研究重点会关注首参颗粒对TLR4相关通路的深入研究，以进一步明确其作用靶点。

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Int ervention Effect Mechanism of Shoushen Granule on Atherosclerosis Based on the Expression ofTLR4，MCP-1 and ICAM-1 in ApoE-/-mice

SHEN Dingzhu，XING Sanli，CHEN Chuan，et al.Shanghai Geriatric Institute of Chinese Medicine，Shanghai 200031，China.

Objective：To investigate the effect of Shoushen Granule on the Toll like receptor 4（TLR4），serum monocyte chemokine-1（MCP-1）and intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）of ApoE-/-mice.Methods：Animal model of atherosclerosis was made with ApoE-/-mice fed with high fat diet，and intervented with Shoushen Granule and atorvastatin for 15 weeks respectively.Expression of TLR4 protein in mice aorta was detected with Western blotting method，and expression of serum MCP-1and ICAM-1 was detected with ELISA method in combination with serum lipid and tissue pathology.Results：Compared with the normal group，high fat diet fed ApoE-/-mice could induce significant AS lesions and the expression of TLR4，MCP-1，ICAM-1，TC and LDL-C increased significantly.After intervention of Shoushen Granule，AS patch area decreased significantly，and the expression of TLR4，MCP-1，ICAM-1，LDL-C and TC decreased evidently（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Shoushen Granule can down regulate the expression of TLR4 protein，in mice aorta and serum MCP-1 and ICAM-1，and then can effectively intervene the treatment of AS.

Atherosclerosis；TLR4；MCP-1；ICAM-1；Shoushen Granule

R285.5

A

1004-745X（2017）02-0192-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.002

2016-11-03）

国家自然科学基金项目（81202731，81373706）；上海市自然科学基金项目（16ZR1433900）；上海市卫计委科研项目（201640217）

△通信作者（电子邮箱：13818279131@163.com，ch9453@126.com）