刘祥，王敏，陈求稳,*，陈凯，胡柳明

1. 南京水利科学研究院生态环境研究中心，南京 210029 2. 河海大学环境学院，南京 210098

随着城镇化和工业化的快速发展，大量地表径流及工业废水排入水体，各种污染物负荷逐年增加。近年来，因重金属而引发的突发污染事件和生态问题相继出现，中国七大水系中如长江、淮河等也遭受了不同程度的重金属污染[1-2]，导致鱼类突发性死亡，周边居民癌症频发等。虽然排入水体的重金属离子大部分可以通过物理、化学和生物的途径转移至沉积物中，但在水力因子改变的条件下，容易释放到水中引起二次污染[3]。水生生物长期暴露于污染水体中，因易富集溶解在水中的重金属离子而受到毒害作用，甚至基因受到损伤而导致遗传特性被改变[4-6]。同时，重金属可通过食物链的生物放大作用逐级传递，对水生态系统健康产生巨大冲击，最终严重威胁到人类的健康。因此，水体中低浓度重金属的慢性生物毒性及其复合污染交互作用机制已逐渐成为淡水生态学领域的研究热点。

日本沼虾(Macrobranchium nipponense)，又名河虾，广泛分布于我国江河、湖泊和水库中，是一种具有重要经济价值的甲壳类水生动物，在水生态食物链中占据重要地位，不仅可以摄食水中有机碎屑降低污染，而可以作为更高营养级生物的饵料[7]，还也可以被人直接食用。镉(Cd)和铅(Pb)在我国江河湖泊中属于典型重金属污染物，检出浓度较高，同时也是国际公认的有毒有害重金属，早在1976年就被美国环境保护局(EPA)列为优先控制污染物。Cd主要会对生物体呼吸道产生刺激，并可积存于肝或肾脏造成毒素富集；Pb主要对生物体神经系统的毒性效应突出，并且容易积存在血液或骨骼中产生毒害作用[6-8]。传统化学监测只能对Cd和Pb精确定量，而并不能准确反映其对生物的毒性效应。随着分子生物学技术的发展，生物监测技术逐渐受到研究者的青睐并作为环境监测领域内的一门新兴技术逐渐被推广应用，其工作原理是通过监测生物体在受到污染胁迫时，在群落、种群和生物个体以及细胞、分子等水平上发生的异常变化信号来表征污染状况及毒害效应[9-10]。与传统监测相比而言，它具有连续性、科学性、综合性等优点。

对水生生物来说，无论是必需还是非必需重金属，当其浓度在生物体中蓄积超出一定阈值后都会产生大量的活性氧自由基(ROS)而引起机体氧化损伤[9-10]。为维持机体内自由基产生和氧化还原作用之间的动态平衡，生物体自身可以建立抗氧化防御系统来保护机体组织和细胞免受自由基的氧化损伤[9,11]。重金属的致毒效应就是通过激活或抑制抗氧化防御过程中的酶或非酶物质，干扰机体正常的生理代谢[12-13]。原先相关研究多侧重于沉积物中重金属的形态分布、迁移转化规律及生态风险[1-3]，忽略了水体中低浓度重金属及不同重金属联合对水生生物的慢性毒性的研究。因此，本研究基于环境水平设置不同浓度梯度开展河虾在Cd和Pb单一及联合暴露下的慢性毒性实验，以期探明水体溶解性金属离子的致毒效应及交互作用机制，同时，耦合多种生物标志物综合评价不同处理组的生物毒性大小，为水体重金属生态风险预警、水质基准制定及流域水环境管理提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

本文重点研究水体Cd和Pb单独及联合存在时对河虾的慢性生物毒性。在试验过程中，分别采用C4H6CdO4·2H2O和Pb(NO3)2(分析纯，国药集团上海化学试剂公司)配成母液并根据已设定的浓度梯度按照稀释法投加到试验水体中。暴露试验桶的材质为聚氯乙烯，最大容积为40 L。

实验用河虾取自南京某河虾养殖区，实验前暂养3 d适应新环境。为避免因河虾个体大小差异对实验结果引入较大误差，用于暴露实验的河虾平均体长为(6.43±0.21) cm，体重为(2.62±0.15) g。实验用水选用在太阳下暴晒10 d除氯后的自来水，以消除天然水体中残存的微量重金属对实验产生干扰。此外，为了在实验室内模拟现实水环境，在每个暴露装置中培养伊乐藻(Elodea nuttallii)，为河虾提供附着场所且作为青饲料(见图1)。

1.2 实验设计

本实验共包括10个暴露组，分别为对照组、Cd单独处理组、Pb单独处理组以及Cd与Pb联合处理组，其中含有重金属污染的处理组均分低(L)、中(M)、高(H)3个浓度梯度。本研究采用的Cd和Pb的污染浓度梯度为0.01、0.1、1 mg·L-1，2种重金属联合暴露采用的浓度梯度组合为(0.01+0.01)、(0.1+0.1)、(1+1) mg·L-1。每个实验桶中分别盛装25 L水，根据浓度梯度设定值，按照稀释的方法将配好的母液投加到实验桶中并用玻璃棒搅匀水体。然后将实验用河虾随机分为10组，每组24只投加到每个实验桶中，并添加一定量的伊乐藻。控制水温不超过10 ℃并用空气泵进行水体增氧，保证水中溶解氧的浓度不低于4 mg·L-1。每隔1天喂少量麦麸保证河虾基本的能量需求。分别在暴露3 d和10 d后，平行取河虾生物样品3只，解剖取出肝胰腺与肌肉组织，迅速在-80 ℃下冰冻保存用于后续分子生物标志物检测分析。

1.3 检测分析

选用超氧化物歧化酶(SOD, U·mg-1Protein)、过氧化氢酶(CAT, U·mg-1Protein)、金属硫蛋白(MT, ng·mg-1Protein)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA, nmol·mg-1Protein)作为代表性分子生物标志物，生物样品分别为河虾肝胰腺和肌肉组织，分别测定4种标志物，具体测定操作和计算按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理

实验结果采用IBM SPSS Statistics 22进行组间差异显著性的多重比较检验(LSD)和2×2析因设计方差分析。析因分析中的交互作用即为联合作用中的协同或拮抗作用，若无交互作用，则联合作用为相加作用。生物标志物数据均用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，所有结果都采用Shapiro-Wilk和Levene方法进行常态和同方差性检验，采用单因素方差分析(ANOVA)进行组间统计学分析，处理组与对照组以及处理组之间采用Dunnett T3检验法进行差异显著性水平的分析，其中P<0.05被认为具有显著性，并以不同字母标注。

综合生物标志物指数(IBR)计算参照文献[14]中所描述的方法，具体计算公式如下所示。最后把不同处理组的IBR值绘制成可视化的星状图，根据IBR值越大，生物所受的影响越大的原理可以直观地看出Cd和Pb单独及联合暴露在不同浓度梯度下对河虾产生的生物毒性大小。

图1 河虾在不同重金属处理组下的暴露示意图Fig. 1 Schematic diagram of river shrimp exposed to different heavy metals with different concentrations

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 Cd和Pb单独及联合暴露下SOD和CAT的响应

暴露试验结果表明：水体中Cd浓度达到1 mg·L-1时，将会对河虾产生致死毒性(36 h后全部死亡)；当Cd与Pb高浓度联合作用时，致死毒性增强(24 h后全部死亡)，表现为协同作用，因而在这2个处理组中没有采集到活体生物样品用于标志物的分析。同一生物体不同组织器官对金属污染物的响应也存在显著差异(P<0.05)，Cd和Pb单独及联合暴露下河虾肝胰腺和肌肉组织内SOD活性随浓度和时间的变化如图2(A)所示。从图中可以看出，肝胰腺中SOD活性显著高于肌肉(P<0.05)，相比于对照组，肝胰腺与肌肉中SOD活性均受到重金属不同程度的抑制作用。暴露3 d时，肝胰腺中SOD活性均随剂量增加而降低，其中Cd单独暴露对肝胰腺SOD活性的抑制效应较为显著(P<0.05)，在Cd (M)-3 d时SOD值为(67.03±5.44) U·mg-1Protein，抑制率为65.61%，10 d后，肝胰腺SOD活性均有所提高，但仍低于对照组，Pb高浓度单独暴露3 d的抑制率为54.08%，而10 d的抑制率为29.11%，中等浓度联合暴露3 d的抑制率为66.57%，而10 d的抑制率为44.13%。然而，对于肌肉中SOD活性均随着剂量和时间的增大而减小，在处理组Pb (M)-10 d处达到最低值，为(3.61±0.47) U·mg-1Protein，抑制率为70.02%。

图2 Cd和Pb单一及联合暴露下河虾肝胰腺(左)和肌肉(右)的SOD活性(A)和CAT活性(B)的响应注：不同字母表示相互之间存在显著性差异(P<0.05)。Fig. 2 The changes of SOD activity (A) and CAT activity (B) in hepatopancreas (left) and muscle (right) of shrimp exposed to control, Cd and Pb (single or in combination)Note: Bars not sharing common letters were significantly different from each other (P<0.05).

Cd和Pb单独及联合暴露下河虾肝胰腺和肌肉组织内CAT活性随浓度和时间的变化如图2(B)所示。从图中可以看出，重金属污染对河虾体内的CAT活性具有诱导效应。Cd单独暴露时，肝胰腺CAT活性随浓度增加而增加，但无显著时间效应(P<0.05)，在Cd (M)暴露3 d与10 d的CAT值分别为(0.46±0.07) U·mg-1Protein和(0.44±0.04) U·mg-1Protein；Pb单独暴露时，无论3 d还是10 d，肝胰腺CAT活性在低中高3个暴露梯度下均呈现先增后降趋势且中浓度下无时间效应；联合暴露时，CAT活性整体高于对照组水平(P<0.05)，但无显著剂量和时间效应(P<0.05)。暴露3 d时，肌肉中CAT活性均受到诱导并表现出微弱的剂量效应，在Pb (H)-3 d下达到最大值，为(0.48±0.04) U·mg-1Protein；但暴露10 d后，CAT活性均有所降低，尤其在Cd单独暴露下表现显著(P<0.05)，然而相比对照组而言，总体上还是呈诱导趋势。

2.2 Cd和Pb单独及联合暴露下MT和MDA的响应

Cd和Pb单独及联合暴露下河虾肝胰腺和肌肉组织内MT含量随浓度和时间的变化如图3(A)所示。从图中可以看出，肝胰腺中MT含量随不同重金属浓度变化呈现不同的抑制或诱导效应，相比于肌肉组织，其敏感性更高。Cd单独暴露3 d时，肝胰腺MT含量显著高于对照组(P<0.05)，且随浓度增加而增加，而在低浓度下暴露10 d时，MT含量显著降低(P<0.05)；Pb单独暴露3 d时，肝胰腺MT含量显著高于对照组(P<0.05)，且在中等浓度下达到最大值，暴露10 d后，MT含量在高浓度下被继续诱导，达到全组最大值(0.60±0.06) ng·mg-1Protein，而在中等浓度下被显著抑制；联合暴露时，MT含量表现出剂量和时间效应。然而，对于肌肉中MT含量变化，整体无显著变化，仅在联合暴露下呈现出显著的时间和剂量效应(P<0.05)，在高浓度下联合暴露10 d后，达到全组最大值(0.31±0.03) ng·mg-1Protein。

Cd和Pb单独及联合暴露下河虾肝胰腺和肌肉组织内MDA含量随浓度和时间的变化如图3(B)所示。从图中可以看出，水体重金属污染对河虾肝胰腺的氧化损伤要显著高于尾部肌肉，MDA含量存在数量级差异。Cd单独暴露3 d时，肝胰腺中MDA含量显著高于对照组(P<0.05)，且呈现显著剂量效应，10 d后，低浓度组MDA含量显著降低(P<0.05)，而高浓度组MDA含量显著升高，达到(16.50±1.02) mmol·mg-1Protein；Pb单独暴露时，MDA含量变化与MT含量变化呈现相同的规律，在Pb (H)-10 d处引起的脂质过氧化损伤最大(P<0.05)，MDA含量达到(20.01±1.27) mmol·mg-1Protein；联合暴露时，MDA含量变化无显著时间和剂量效应，且整体低于单独金属暴露时所引起的脂质过氧化损伤，但仍然显著高于对照组(P<0.05)。然而，对于肌肉组织来说，仅在Pb (H)-10 d处MDA含量相对较高，其余变化不大。

2.3 Cd和Pb联合效应分析

采用2×2析因设计方差分析对Cd和Pb不同浓度联合对河虾肝胰腺SOD、CAT、MT和MDA的交互作用进行了研究，结果显示2种污染物联合作用大多表现出拮抗作用(图4)。Cd与Pb同时不添加即为对照组，Cd添加Pb不添加即为Cd单独暴露组，Cd不添加Pb添加即为Pb单独暴露组，Cd与Pb同时添加即为联合暴露组。在暴露3 d时，Cd和Pb低浓度联合对MDA产生的交互作用最强(图4A)，Partial Eta2值显示，各暴露组对MDA变化的贡献大小顺序为Cd+Pb (L)>Pb (L)>Cd (L)；在暴露10 d时，低浓度联合仍然表现出对MDA的交互作用最强且贡献大小顺序保持不变，但对SOD和MT产生的交互作用均有所减弱，Partial Eta2值显示，各暴露组对SOD活性变化的贡献大小顺序为Cd (L)>Pb (L)> Cd+Pb (L)，对MT含量变化的贡献大小顺序为Pb (L)> Cd (L)> Cd+Pb (L)，尤其Cd与Pb联合对MT甚至已表现出相加效应。

图4 Cd/Pb低浓度(A)和中等浓度(B)对河虾肝胰腺分子标志物SOD、CAT、MT和MDA的交互作用注：两直线夹角越大表明交互作用越强，如两直线随污染物剂量的增大而靠近或交叉，则表明2种污染物联合作用表现为拮抗作用。Fig. 4 Cd-Pb interaction effect under low concentration (A) and middle concentration (B) on hepatopancreatic biomarkers including SOD, CAT, MT and MDA in shrimpNote: The greater the angle of two straight lines, the stronger the interaction between variables. The variables are antagonism when the two lines next to or cross with each other as the contaminants kept increasing.

Cd和Pb中等浓度联合对河虾肝胰腺SOD、CAT、MT和MDA的交互作用如图4(B)所示。从图中可以看出，重金属联合对河虾肝胰腺中分子标志物均产生交互作用。在暴露3 d时，Cd和Pb中等浓度联合对MDA产生的交互作用最强，Partial Eta2值显示，联合暴露对CAT和MDA变化的贡献大小顺序均为Cd+Pb (M)> Pb (M)> Cd (M)，对MT含量变化的贡献大小顺序则为Cd+Pb (M)> Cd (M) > Pb (M)；在暴露10 d时，联合暴露对CAT产生的交互作用最强，Partial Eta2值显示，Cd和Pb单一及联合下对CAT活性变化的贡献大小顺序为Cd+Pb (M)> Pb (M)> Cd (M)，而对SOD、MT和MDA变化的贡献大小均为Cd (M)> Cd+Pb (M)> Pb (M)。

2.4 不同金属及联合生物毒性评价

本实验中不同暴露时间、不同重金属处理下的综合生物标志物指数分析结果如图5。研究发现：Cd和Pb单独暴露对肝胰腺产生的毒性较大，尤其Cd致毒效应突出，在Cd (M)下暴露3 d，IBR值高达3.27，10 d后，IBR值仍保持最大值，为2.66；对于肌肉来说，Pb单独暴露产生的致毒效应显著高于其他处理组，尤其在Pb (H)下暴露3 d后，生物毒性最大，IBR值为3.17，10 d后，IBR仍保持最大，为2.00。此外，河虾暴露于Cd和Pb共存的水体中，随着暴露时间的延长，机体自身表现出一定的解毒机制，但毒性依然高于对照组。无论是肝胰腺还是肌肉组织，暴露10 d后的IBR值总体均小于3 d时的IBR值，表明河虾自身对Cd和Pb具有一定的毒性调控能力，但并不能完全对抗重金属所产生的毒性。

3 讨论(Discussion)

3.1 重金属单一及联合作用

天然水体中，往往是多种重金属同时存在，对于某一生物来说常常存在联合交互作用。迄今为止，水环境生态毒理学中所提及的交互作用主要包括协同作用、相加作用、独立作用和拮抗作用[12]。然而，水体中有毒有害重金属对水生生物的联合作用是一个很复杂的问题，其联合毒性类型不仅与污染物的组成有关，而且与目标生物、暴露浓度及时间等密切相关。研究发现，在一定浓度的重金属胁迫下，重金属可与生物体蛋白质等高分子物质结合，影响蛋白质的分解与合成而扰乱正常新陈代谢[9,20]。

本研究为深入认识水体中典型重金属Cd与Pb对河虾的毒性机制，从金属单一及联合暴露入手，考虑不同浓度梯度和暴露时间的影响，进行室内暴露实验。实验结果显示：当河虾暴露于含Cd浓度为1 mg·L-1的水体中，河虾会在36 h内全部死亡，尤其Cd与Pb高浓度联合下，毒性增强，这主要是因为Cd在河虾体内积累达到一定程度后，细胞中蓄积的Cd含量超过了生物体中MT对它的螯合速率时，过剩的Cd就会与其体内的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，进而引起中毒致死现象；吴丰昌等[15]在研究中指出，水体中Cd浓度超过15 μg·L-1时对罗氏沼虾会产生急性毒性，这一结果表明罗氏沼虾对水中Cd的耐受能力要低于日本沼虾。研究表明水体中Cd对甲壳动物的致死毒性约是Pb的50倍[16]。然而，高浓度联合毒性增强的主要原因是Pb可以增加机体细胞膜的通透性，导致更多的Cd进入细胞而过剩积累，引起毒性增强[12]。在剩余处理组中，根据典型分子生物标志物响应变化(图2，3)，Cd与Pb的单独毒性均高于其联合毒性且其联合效应主要表现为拮抗作用。这一结果可以用竞争点位理论(competitive site theory)来解释：金属离子进入细胞前先要与细胞表面的接受点位结合，而当Cd与Pb在低或中等浓度下共存时，Pb并不发挥增加细胞膜通透性的作用，而是与Cd一起竞争接受点位，因此而产生拮抗作用。

图5 不同重金属暴露下IBR响应图注：A为肝胰腺，B为肌肉组织。Fig. 5 Star plots of IBR from different exposure groups with heavy metals (Cd and Pb) during different periodsNote: A, hepatopancreas sample; B, muscle sample.

3.2 典型分子生物标志物响应

生物标志物是生物机体受到外源污染物胁迫损害前，在不同分子、细胞上产生的异常化的信号指标，它们可以对严重毒性伤害提供早期预警，可以揭示某一生化代谢过程的变化或异常代谢产物的生成[17]。一般认为，外源性有毒有害物质主要通过影响或阻断呼吸链、电子传递链、酶促反应等体内正常生理代谢，导致活性氧自由基增加而使机体处于氧化应激状态[18-19]。然而，为消除或减缓因活性氧累积而产生的氧化损伤，生物体内的各种酶和非酶抗氧化剂联合作用可以构成抗氧化防御系统，其中SOD和CAT是生物体耐受污染胁迫的重要抗氧化酶[20]，MT是典型的重金属特异性分子标志物，具有维持生物体内金属含量的动态平衡和重金属解毒作用的双重机制[5]，MDA是反映机体脂质过氧化损伤最具代表性的生物标志物，其含量变化可以直接表明生物受损伤大小[5]。因此，以抗氧化生物标志物的活性和含量为测试终点不仅可以间接地反映河流水体中重金属的存在及其潜在的慢性生物毒性，而且可以弥补原先化学监测的缺陷，科学地进行重金属污染物的早期诊断和水环境健康评价。

河虾属于典型的甲壳动物，自身不具有免疫球蛋白，对机体的保护作用主要由血细胞来承担；河虾肝胰腺中含有离子转移酶、解毒酶以及抗逆酶，是机体主要的解毒器官。实验结果表明，肝胰腺中SOD活性和敏感性均高于肌肉，这主要由于其生理功能不同所致。在整个防御系统中，SOD是最先与活性氧自由基作用的酶，且主要分布在肝胰腺中，它可以快速将超氧阴离子分解成H2O2和O2。已有研究表明[21]，当生物机体受到轻度污染胁迫时，SOD活性往往被激活，相反可以推断，当SOD活性呈现抑制效应则表明机体对该种胁迫的不适性或已出现中毒反应。本研究Cd与Pb单一及联合暴露对肝胰腺和肌肉组织中SOD活性均呈现抑制效应，表明重金属对河虾已造成慢性致毒效应，尤其Cd对肝胰腺SOD活性的抑制最为突出。很多学者认为，造成这种结果的原因可能是：Cd2+离子更易取代Cu/Zn-SOD中的Zn2+或Mn-SOD中的Mn2+，导致SOD结构变化而活性降低；其次，Cd2+可能与酶分子中的-SH基团发生结合，也是SOD活性减小的一个重要原因[22]；另外，Cd也能够与SOD相互作用，致使蛋白质改性而改变其活性[23]。然而，由于河虾肝胰腺自身含有一些解毒酶，在暴露10 d后对Cd和Pb也表现出一定的适应性，SOD活性增强，但仍低于对照组。对于肌肉组织，Pb对SOD的活性抑制相对显著，这可能与不同器官执行不同的生理功能有关，且Pb更容易进入血液而传送到肌肉组织中。CAT是一种末端血红素氧化酶，在抗氧化防御系统中其主要作用就是催化H2O2分解为H2O和O2，防止H2O2蓄积量过高对机体组织造成损伤[24]。本研究中CAT活性在重金属Cd和Pb胁迫下大体呈现出诱导效应(图2B)，主要是因为Cd和Pb离子进入肝胰腺细胞后，导致细胞内产生大量的活性氧，致使产生氧化压力，为保护机体细胞，CAT活性被激活，然而，CAT活性在Pb低中高3个浓度梯度上表现先增后降的抛物线趋势，主要原因可能是暴露初期，生物机体自身抗氧化防御系统可以通过自身调节对抗这部分因重金属引起的ROS，而随着外界Pb浓度的持续增加，肝胰腺细胞内Pb离子浓度急剧增加，一方面抑制了CAT的生成，另一方面细胞受损，细胞内的活性氧自由基的平衡破坏，致使CAT活性降低[25]。

MT是一类低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质，MT上的Cys残基含有易与重金属结合的疏基，可以预测生物体对重金属的富集状况和受重金属的污染压力[5]。同时，由于MT能够通过自身羟基还原态/氧化态的转换来清除活性氧自由基，在一定程度上可以取代SOD来保护机体免受氧化损伤[4]。本研究结果中肝胰腺中MT含量高于肌肉，表明肝胰腺对重金属的富集能力高于肌肉且间接反映肝胰腺河虾主要的解毒器官。在暴露3 d后，肝胰腺MT含量显著提高，主要是因为细胞富集了大量了金属离子，均能与MT结合。然而，较低浓度下，随着暴露时间延长，MT含量不再上升，甚至出现下降趋势，其原因可能是细胞膜表面的重金属受体点位逐渐饱和，或过量金属离子超过MT的结合能力，使肝胰腺细胞器解体而导致粗面内质网的片断化[4-5]。

MDA既是机体内脂质过氧化反应的重要产物，同时又可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内与分子间交联，导致细胞损伤[26]。图3B结果显示，河虾肝胰腺对0.01 mg·L-1的Cd和0.01、0.1 mg·L-1的Pb均具有一定的毒性调节功能，然而在0.1 mg·L-1的Cd和1 mg·L-1的Pb下暴露10 d后河虾肝胰腺均会受到较大的氧化损伤，细胞中MDA含量较高(图3B)，这种结果与众多污染胁迫动态研究结果相类似。产生这种现象的原因可能是，由于重金属胁迫，河虾体内活性氧自由基水平过高，超出机体抗氧化防御系统的能力，过剩的活性氧自由基攻击生物膜磷脂中不饱和脂肪酸双键而导致脂质的过氧化反应，MDA含量随之升高。然而，在较低浓度下，暴露10 d后，MDA含量反而有所下降，主要原因可能是抗氧化酶系统酶活性在低浓度下表现出一定耐受性，活性氧自由基的诱导下，其活性增强，从而增强了清除活性氧自由基的能力，降低活性氧自由基的水平，但仍然不能对抗高浓度所引起的氧化损伤。其次，在相同的胁迫时间下，肝胰腺的脂质过氧化程度要高于肌肉，说明即使是同一污染物对生物体产生的胁迫，不同部位脂质过氧化水平也不一样。

3.3 IBR综合评价

Cd和Pb是具有潜在危害的水环境污染物，与其他污染物相比，其风险在于它们不能被微生物降解、易生物富集、食物链传递放大，且易与生物体内的蛋白质等生物大分子结合，造成不可逆转的变性，干扰正常的生理代谢过程，甚至可以引起DNA突变改变遗传特性[13]。因此，科学准确地进行重金属生物毒性评价是当前河流生态健康评价与风险评估的基础工作。传统重金属生物毒性评价大多基于半致死浓度(LC50)，往往提高了毒物的风险浓度，忽略了低浓度重金属及多种金属联合时的慢性生物毒性，与现实河流污染现状难以接轨。然而，本研究基于环境水平设置不同浓度梯度进行室内暴露实验，通过测试代表性分子标志物揭示重金属慢性毒性。由于单一生物标志物很容易受到其他因素的干扰，且不同生物标志物对不同污染物的响应程度存在差异，因此，单一生物标志物很难准确对污染物作出全面评价。本文采用IBR指数，综合不同生物标志物对不同重金属处理组的生物毒性评价，不仅可以避免单一生物标志物的不确定性，也可以更准确更科学地比较不同浓度梯度重金属的慢性毒性大小，为水环境管理及风险基准制定提供依据。

综上所述：(1) 当水体中Cd浓度达到1 mg·L-1时，河虾就会出现毒性致死，且与同浓度的Pb联合时，致死毒性增强，表现为协同作用；析因方差分析发现，Cd与Pb分别在0.01和0.1 mg·L-12个梯度下联合时，无论对肝胰腺还是尾部肌肉，对4种标志物均表现为拮抗作用。

(2) 肝胰腺与肌肉组织中SOD活性与MDA含量存在数量级差异。Cd和Pb单独及联合时，肝胰腺与肌肉中SOD活性均受到抑制，10 d后，肝胰腺中SOD活性少许增强，而肌肉中SOD活性仍被抑制；CAT活性绝大部分被激活，10 d后，肝胰腺中CAT活性继续被激活，肌肉中CAT活性反而降低，尤其Cd抑制效应显著；肌肉中MT和MDA含量组间变化较小，在肝胰腺中两者变化规律类似；联合暴露下，4种标志物的时间效应微弱。

(3) IBR生物毒性评价发现，河虾自身在时间尺度上具有一定的重金属解毒功能；相比而言，Cd对肝胰腺的潜在生物毒性较大，尤其Cd浓度为0.1 mg·L-1时，IBR值始终最大，而对于肌肉，Pb的潜在生物毒性较大，尤其Pb浓度为1 mg·L-1时，10 d后，IBR值仍最大；Cd与Pb联合毒性要低于单一金属。

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