蔡全领，胡献刚，周启星

南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室/天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室，天津300350

纳米材料是一种具有很大比表面积的新型材料，由于其化学催化活性的显著增加，常广泛应用于工业、材料、医药、环保以及电子等行业。纳米材料可以穿透生物膜进入体内直接影响细胞，所以其合成、使用、废弃过程中的生物安全性得到了人们的广泛关注。

石墨烯是目前已知最薄的、应用广泛的新兴非金属纳米材料，厚度仅为一个碳原子，是一种由碳原子组成的六角形蜂巢晶格的二维结构材料[1-3]。石墨烯具有独特的电学机械性能、良好的导热导电性、超大的比表面积以及潜在的生物相容性，被广泛应用于材料、电子、能源、光学以及生物医学等领域，如电化学设备、能源存储、细胞成像、药物输送和生物传感器等[4-8]。随着石墨烯在实际生活中的大规模生产和应用，石墨烯的环境行为和生物毒性研究备受关注。目前，已有大量研究证实石墨烯纳米材料的生物毒性因其自身的物理化学性质(尺寸、形态、官能团等)、作用浓度、生物的摄入方式及作用器官等的不同而不同[9-12]。不同的石墨烯及其衍生物具有不同的理化性质和生物毒性，通常情况下，石墨烯可分为单层石墨烯、少数层石墨烯、石墨烯氧化物(GO)、还原型石墨烯氧化物(rGO)、石墨烯纳米带、石墨烯薄片及量子点石墨烯等[13]。由于受官能团的影响，石墨烯纳米材料的生物毒性主要集中于对石墨烯氧化物和还原型石墨烯氧化物的研究。本文以石墨烯氧化物和还原型石墨烯氧化物为主体，总结了石墨烯纳米材料的生物毒性的相关研究。

哺乳动物试验表明，石墨烯可以通过气管滴注[14]、吸入[15]、静脉注射[16]、腹腔注射[17]以及口服[18]等方式进入体内，通过血液-空气屏障、血脑屏障和血液胎盘屏障等积累在肺、肝、脾等部位引起急性或者慢性损伤[19]。有关石墨烯毒性机制的研究主要集中于线粒体损伤[20]、DNA损伤[21]、炎性反应[19]、凋亡[22]等终点及氧化应激[20]参与的复杂信号通路。不同石墨烯纳米材料的浓度、尺寸、表面结构和官能团等对石墨烯的生物毒性影响不同[13]。本文对不同实验方法下石墨烯纳米材料的个体毒性、细胞毒性、毒性影响因素及毒理作用机制研究进行总结，为石墨烯材料广泛应用的生物安全性提供理论指导。

1 石墨烯纳米材料的动物毒性(Animal toxicity of graphene nanomaterials)

大量有关石墨烯的动物毒性(图1)研究证明，在通常情况下，石墨烯纳米材料可以通过不同暴露方式穿过不同的生理屏障或细胞结构进入动物体内，从而导致生物毒性的发生。不同暴露方式、不同的生理屏障、不同的组织分布和排泄都是影响石墨烯纳米材料毒性的决定因素。因此，对影响因素的全面了解有助于更好地理解和把握石墨烯毒性的发生和发展。

图1 石墨烯纳米材料的动物毒性Fig. 1 Animal toxicity of graphene nanomaterials

1.1 暴露方式(Exposure method)

动物模型中常用的暴露方式包括吸入、口服、气管滴注、静脉注射、腹腔注射以及皮下注射等。虽然吸入暴露是最接近现实生活的暴露模型，但滴注模型是更有效、更节省时间且会产生长期炎性的暴露方式。吸入暴露和气管滴注通常会导致肺部炎性的发生。3项大鼠吸入暴露低剂量石墨烯及GO的研究对比发现，石墨烯和GO引起雄性大鼠的肺损伤和炎性是可逆的[23-25]。而石墨烯的气管滴注模型对小鼠产生急性肺部损伤和炎性[14,26]，并且气管滴注的石墨烯纳米材料会在小鼠肺部积累并滞留3个月以上[27]。静脉注射、腹腔注射和皮下注射可对小鼠产生系统毒性。在用小鼠静脉注射石墨烯纳米材料的毒性研究中，石墨烯通过30 min的体内循环便可积累到一定浓度并沉积在肝脏，且石墨烯在肺、肝、脾的沉积至少可持续6个月[28-29]。腹腔注射模型中GO会聚集到注射部位附近，少数GO会渗透到邻近肝脏和脾脏的结缔组织等部位[30-31]。皮下注射GO 3周后，在注射部位出现轻微炎性[32]。然而小鼠口服模型中，氧化石墨烯衍生物没有出现明显的组织吸收，并可以被迅速排泄[30]。

1.2 生理屏障(Physiological barrier)

由于石墨烯纳米材料尺寸小，通过不同暴露方式进入动物体内后可通过血液-空气屏障、血脑屏障和血液胎盘屏障积累并滞留在肺、肝、脾等不同部位引起炎性等生理毒性。

1.2.1 机械屏障

皮肤与粘膜构成动物个体机械防御的第一道防线。由于动物的石墨烯暴露途径主要是吸入，所以明确石墨烯纳米颗粒通过机械屏障发挥毒性的作用机制是生物安全性研究的热点。研究证明，通过呼吸进入哺乳动物体内的石墨烯纳米颗粒经过呼吸道黏膜层的过滤作用后可到达肺部，破坏肺部的超微结构和生理特性，从而发挥毒性作用[33]。虽然黏液可以阻挡病原菌或者超细颗粒进入眼睛、呼吸系统以及胃肠道等[34]，但目前有关石墨烯与黏液的相互作用未见报道。肺部对石墨烯颗粒的清理工作主要依赖于肺泡巨噬细胞和上皮细胞[35]，凝聚态的石墨烯粒子沉积在肺泡内表面，进而被肺泡巨噬细胞吞噬，而一些小的可吸入的纳米颗粒会渗透并进入肺泡上皮细胞或间质细胞[35]。目前有关石墨烯沉积并渗入皮肤的路径和机理还并不是很清楚，亟待研究。

1.2.2 血脑屏障

血脑屏障可以选择性地阻止某些外来物质由血液进入大脑，限制物质在血液与脑组织的自由交换，由大量膜受体和载体组成。目前有关石墨烯是否能通过血脑屏障引起神经毒性的研究暂无定论。有报道认为石墨烯不能穿过血脑屏障[36]。而目前有研究发现，聚乙二醇修饰的rGO会以时间依赖方式进入内皮细胞间隙，破坏血脑屏障导致星形胶质细胞功能障碍[37]。另有研究指出，尺寸小于100 nm的石墨烯量子点可直接穿透血脑屏障[38]。

1.2.3 胎盘屏障

胎盘屏障是母体与胎儿进行营养物质和代谢产物交换的器官，可以阻止有害物质进入胎儿，是母体怀孕期间必不可少的保护胎儿的防御性屏障。有关纳米材料胚胎毒性的研究引起了广泛关注，报告显示，100 nm以下的纳米颗粒可以通过胎盘进入胎儿血液中影响胎儿的生长发育[39]，这也说明石墨烯及其衍生物是极可能进入胎盘的。一些研究表明，孕前或妊娠早期低剂量静脉注射rGO的小鼠母体产生的后代出现少量畸形，而妊娠后期低剂量注射rGO的母体产生的后代出现大量异常，高剂量注射rGO会直接导致母体死亡[40]。

1.3 系统毒性(Systemic toxicity)

1.3.1 呼吸系统的毒性

呼吸系统是石墨烯的直接作用系统，目前有关石墨烯造成呼吸系统损伤的研究是最多的。实验报道，人体吸入的绝大多数石墨烯纳米颗粒会穿过上呼吸道进入到肺部，在肺部沉积，呼吸道检测到的石墨烯纳米颗粒沉积率小于4%[41]。因此，石墨烯诱发肺损伤是石墨烯动物毒性的主要症状。氧化石墨烯纳米材料暴露后的小鼠出现明显的急性肺损伤和慢性纤维肺，但通过抗炎、抗氧化药物地塞米松的治疗后可以得到缓解，说明GO可能通过氧化应激引起肺毒性的发生[42]。但是GO通过修饰后可以明显降低其肺毒性，尾静脉注射聚乙二醇修饰的GO至小鼠体内，90 d内并没有引起肺损伤[43]。

1.3.2 中枢神经系统的毒性

目前有关石墨烯纳米材料的中枢神经系统毒性研究较少且不统一。100 μg·mL-1的rGO会影响大鼠星形胶质细胞和大脑内皮细胞的细胞活性，而聚乙二醇修饰的rGO对细胞产生损伤甚至引起细胞死亡[44]。但也有实验报道，石墨烯材料的暴露对神经网络中突触的形成和功能没有影响[45]。因此，石墨烯纳米材料的神经毒性影响需要进一步的研究。

1.3.3 生殖和发育系统毒性

石墨烯纳米材料对雌雄生殖系统具有不同的毒性作用。数据显示，腹腔注射高剂量的GO对雄性生殖系统几乎没有影响[46]。对于妊娠早期注射rGO的雌鼠，其后代只有少数出现异常，然而妊娠后期注射rGO会导致孕鼠流产甚至死亡[40]，在哺乳期，高剂量注射rGO的后代出现发育延迟。哺乳期间口服高剂量GO造成后代生长迟缓[47]。虽然研究结果表明石墨烯纳米材料具有生殖和发育毒性，但目前有关石墨烯对雌雄生殖和发育影响的研究数据较少，需进一步阐明其潜在的毒性机制。

2 石墨烯纳米材料的细胞毒性(Cytotoxicity of graphene nanomaterials)

2.1 在细胞中的吸收

石墨烯纳米材料在不同细胞中的吸收和定位不同，石墨烯可通过多种途径进入细胞。石墨烯材料的大小、形状、表面修饰等物理化学参数决定了其穿过细胞膜的能力。不同尺寸的石墨烯材料对细胞的穿破程度不同，直径小于100 nm的纳米颗粒物可以进入细胞，小于40 nm的可以进入细胞核[48]。蛋白修饰的氧化石墨烯纳米大颗粒(～1 μm)主要通过吞噬作用进入细胞，而小的氧化石墨烯纳米颗粒(～500 nm)主要通过内吞作用进入细胞[49]。现有证据证实，GO可与质膜相互作用被吞噬细胞吞噬，其中巨噬细胞三大受体：Fcg受体(FcgR)、甘露糖受体(MR)和补体受体(CR)在这一过程中起重要作用[50]。此外，GO可以通过其表面的含氧官能团粘附到细胞膜上，插入磷脂双分子层与细胞相互作用内化到细胞内，聚乙二醇修饰的rGO可通过与细胞膜的疏水作用粘附到磷脂双分子层[51]。由此可见，长期高浓度的石墨烯纳米材料暴露会对细胞膜产生物理损伤，造成细胞骨架的不稳定。

2.2 细胞毒性

大量体外实验表明，石墨烯纳米材料的毒性表现为改变细胞活性，改变细胞形态、破坏细胞膜的完整性[52]，进入溶酶体、线粒体、细胞核以及内质网等诱导DNA损伤[53]和细胞凋亡[54]。石墨烯是增加细胞活性还是导致细胞死亡取决于细胞类型、石墨烯材料种类及剂量。石墨烯量子点进入小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3 T3后可以诱导DNA损伤[55]，但是其对人类神经干细胞(250 μg·mL-1)并没有产生明显的毒性[56]。相同暴露浓度和时间内GO使A549细胞的活性降低，使CaCo2结直肠癌细胞的活性增加[57]。在一定的浓度范围内，GO不会损害A549的细胞形态、活性以及细胞膜的完整性，但暴露浓度高于50 μg·mL-1时会对A549产生细胞毒性，而GO暴露浓度高于20 μg·mL-1时会对人类成纤维细胞和肺上皮细胞产生细胞毒性[58]。

3 石墨烯及其衍生物生物毒性的影响因素(Influencing factors of biological toxicity of graphene and its derivatives)

3.1 暴露剂量与方式的影响

3.1.1 剂量的影响

石墨烯材料的动物和细胞毒性(如肺、肝和肾损伤、细胞活性的降低和细胞凋亡等)存在剂量依赖效应。有关GO的小鼠体内实验中，低剂量(0.1 mg)和中剂量(0.25 mg)暴露水平没有表现出明显的毒性，但高剂量(0.4 mg)暴露会出现慢性毒性[59]。以10 mg·kg-1体重的量静脉注射GO的小鼠肺部出现炎性细胞浸润、肉芽肿形成和肺水肿等现象，而以1 mg·kg-1体重的量静脉注射GO的小鼠经过1周后会排出GO，并且未观察到明显的病理学反应[27]。此外，体外模型研究报道，石墨烯纳米带处理后HeLa细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3 T3的细胞活性下降具有剂量(10～≥400 mg·mL-1)和时间(12～48 h)依赖性[60]。20 μg·mL-1的GO在2 h的暴露时间内对A549细胞没有毒性作用，而较高浓度(85 μg·mL-1)暴露24 h后细胞活性下降50%[61]。

3.1.2 暴露方式的影响

不同的暴露方式影响石墨烯纳米材料的组织分布和排泄，气管滴注的主要沉积器官是肺部，而静脉注射、腹腔注射和皮下注射由于产生系统炎性，易分布在肝、脾及脂肪等组织。比如气管滴注的少数层石墨烯通过机械屏障主要滞留在肺部且4周后滞留率仍为47%[41]。鼻腔吸入的石墨烯纳米家族材料(GFN)会转移到肺淋巴结[42]。静脉注射的GO通过血液进入循环系统，滞留在肺、肝、脾等器官，最终通过尿液和粪便排出体外[43]。同样地，腹腔注射后在小鼠肝脏和脾脏的网状内皮组织发现大量石墨烯衍生物的积累，而经口服的氧化石墨烯衍生物和少数层石墨烯并没有被胃肠道积累[30]。

3.2 理化性质的影响

3.2.1 尺寸

有关纳米材料的研究证实，尺寸小于100 nm的纳米颗粒可以进入细胞，小于40 nm的可以进入细胞核，小于35 nm的可以穿过血脑屏障[48]。石墨烯直径在100～500 nm之间时，尺寸越小毒性越大，而直径小于40 nm时尺寸越小毒性越小[53]。另有研究指出，小尺寸(直径10～30 nm)的GO薄片主要分布在肝脏和脾脏，而大尺寸(10～800 nm)的GO薄片主要积累在肺部；如果GO的尺寸大于血管尺寸，GO通常会在注射部位附近的动脉和毛细血管聚集[62]。人骨髓间充质干细胞在低剂量(1.0 mg·mL-1)的直径为(11±4) nm的rGO暴露1 h后，rGO能进入细胞核引起染色体畸变并产生DNA碎片，而在高剂量(100 mg·mL-1)的直径为(3.8±0.4) nm的rGO暴露24 h后没有明显的基因毒性[63]。与小的石墨烯相比，较大的GO更易吸附到无吞噬作用的质膜上，与Toll样受体相互作用激活NF-κB通路，更易被细胞吸收[50]。氧化石墨的尺寸与其毒性作用总结如表1。

3.2.2 官能团

石墨烯经过聚乙二醇、普朗克尼、羧基和葡聚糖等官能团的功能化处理后，显著降低了其毒性并使生物相容性增加。体内模型结果显示，GO经聚乙二醇修饰后，可有效减少其引起的急性组织损伤，减少GO在肝、肺、脾中的聚集和滞留，促进GO的清除[29]；皮下注射普朗克尼修饰的GO只表现出轻微的慢性炎症[64]；在血液中，经葡聚糖修饰的GO几乎消除了溶血性[65]。体外模型表明，在浓度高达100 μg·mL-1的情况下，聚乙二醇修饰的GO并没有对人类卵巢癌细胞(MCF-7)、结肠癌细胞(OVCAR-3)和淋巴母细胞(RAJI)等产生细胞毒性[66]。

3.3 器官分布的影响

目前，分布、排泄机制已成为纳米材料毒性研究的重要方向，GO会通过干扰重要器官的正常生理功能导致急性炎性反应和慢性损伤，不同器官对石墨烯纳米材料的积累和清除作用不同。肺部GO的积累随着注射剂量和尺寸的增加而增加，但在肝脏中却是相反趋势[62]。尾静脉注射的高剂量GO主要沉积在肺、肝、脾、肾，并且很难被肾清除。在肺部，石墨烯会被肺泡巨噬细胞吞噬通过黏膜纤毛以痰液形式排出，通过气管滴注后46.2%的少数层石墨烯会在28 d后通过粪便排出[26]。在肝脏中，纳米颗粒可通过肝脏-胆管-十二指肠的途径被清除[67]。最新研究表明，超过200 nm的GO薄片可以被脾物理过滤，而小尺寸的GO薄片可通过肾小管渗透到尿液快速清除，且没有明显的毒性[29]。有关石墨烯纳米材料的排泄机制尚不全面，但肾脏和粪便似乎是石墨烯的主要消除途径。

4 石墨烯及其衍生物的毒理作用机制(The mechanism of biological toxicity of graphene and its derivatives)

4.1 氧化应激

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，即自由基的产生超过了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽氧化酶(GSH)等抗氧化酶水平，对机体产生损伤。活性氧自由基(ROS)会对细胞产生损伤，造成膜脂质分解、DNA碎片、蛋白质变性、线粒体功能障碍等，从而影响细胞功能，导致衰老和疾病的发生[68]。GO与细胞相互作用产生过量的ROS是产生急性肺损伤、炎性反应、细胞凋亡、DNA损伤等的元凶[69]。据报道，SOD和GSH的活性随着GO暴露时间和暴露剂量的增加而降低[59]。石墨烯处理细胞后，由ROS介导的MAPK(JNK、ERK、p38)以及TGF-β信号转导通路，以及与凋亡相关信号(bcl-2、caspase-3)及下游基因PARP等被激活[70]。

表1 氧化石墨烯的毒性作用Table 1 Toxic effect of graphene oxide

注：CCK-8、MTT与WST-8为细胞存活率检测方法，LDH与HA为细胞损伤检测方法。

Note: CCK-8, MTT and WST-8 is the method for the detection of cell survival, LDH and HA for the detection of cell damage.

4.2 线粒体损伤

线粒体是细胞的产能中心，对于维持细胞功能具有重要作用，涉及多种信号传导途径。线粒体受损通常会导致细胞形态和功能受损，据报道，暴露于石墨烯纳米材料后会引起线粒体膜电位下降，钙离子信号通路受阻；GO对线粒体膜电位的影响具有时间、剂量依赖效应[71]。细胞直接暴露于GO会抑制线粒体电子传递链复合体I、II、III、IV的活性，使线粒体膜发生去极化，影响ATP的合成[72]。石墨烯纳米材料可通过影响细胞线粒体功能引起氧化应激、质膜损伤、细胞凋亡和和细胞坏死等。

4.3 DNA损伤

由于GO的体积小、表面积大和表面电荷高，可能会导致染色体断裂、DNA链损伤及点突变、DNA加合物的形成等基因毒性的产生，MAPK、TGF-β、NFκB等信号通路在GO引起染色体分裂、DNA加合物形成和点突变等DNA损伤中起重要作用[53]。以20 mgkg-1的剂量静脉注射GO的小鼠体内发生基因突变；在不同细胞系中，石墨烯和rGO可以增加染色体损伤基因p53、Rad51、MOGG1-1等的表达，降低细胞周期相关蛋白CDK2的表达[53]。

4.4 炎性反应

炎性反应是研究最广泛的一种石墨烯生物毒性，石墨烯纳米材料可以通过释放细胞因子和趋化因子触发炎症反应引起组织损伤。气管滴注和静脉注射高剂量的石墨烯纳米材料可引起动物明显的炎症反应，如炎性细胞浸润、肺水肿和肉芽肿形成等[42]。而静脉注射GO后可以直接刺激血小板增加，形成血栓使肺血管阻塞[73]。石墨烯和rGO可以与细胞内Toll样受体(TLRs)结合，激活NF-κB信号通路引发炎症[74]。

4.5 细胞凋亡

石墨烯和氧化石墨烯会对细胞膜产生物理损伤、增加细胞膜的通透性、改变线粒体膜电位，增加ROS的产生，诱发TGF-β和MAPK信号通路，激活线粒体相关的caspase-3通路，最终导致细胞凋亡[70]。而低剂量早期rGO的暴露可通过死亡受体和线粒体相关途径引发凋亡[52]。另有研究显示，不同石墨烯纳米材料引发凋亡有不同的途径：GO可直接与蛋白受体作用，增加ROS生成，激活bcl-2通路；羧化的GO也直接与蛋白受体作用，激活ROS通路，导致核DNA改变；聚乙烯亚胺修饰的GO通过损伤T淋巴细胞的细胞膜引发细胞凋亡[75]。

4.6 表观遗传

表观遗传分子机制包括DNA甲基化、RNA干扰、基因沉默、组蛋白修饰等，DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰方式。最新研究表明，GO衍生物暴露通过上调甲基转移酶DNMT3B基因引起全基因组甲基化[76]。单层石墨烯和少数层石墨烯引起的全基因组甲基化具有剂量依赖性，不同石墨烯衍生物引起的甲基化水平为：羧化石墨烯>胺化石墨烯>石墨烯[77]。此外，GO可通过激活microRNA-360抑制DNA损伤与凋亡发生[78]。

总之，大量研究已证实石墨烯纳米材料引发线粒体损伤、DNA损伤、炎性反应和凋亡等主要是通过ROS的产生以及4种传统信号通路(TLRs、TGF-β、TNF-α 和MAPKs)的调控发生的。而表观遗传调控作为新型调控机制也可能在石墨烯的生物毒性中发挥重要作用。

5 展望(Prospect)

由于石墨烯纳米材料具有独特的理化性质，在能源和环境等诸多领域得到了应用广泛，其环境行为和生物毒性的研究备受关注。本文通过对石墨烯纳米材料的哺乳动物毒性、细胞毒性、毒性影响因素及毒理作用机制研究进行了全面的总结，为石墨烯材料广泛应用的生物安全性提供理论指导。本文指出，石墨烯可以通过气管滴注、吸入、静脉注射、腹腔注射以及口服等方式进动物体内，通过血液-空气屏障、血脑屏障和血液胎盘屏障等积累在肺、肝、脾等部位引起急性或者慢性损伤。目前有关石墨烯毒性机制的研究主要集中于线粒体损伤、DNA损伤、炎性反应、凋亡等终点及氧化应激参与的复杂信号通路。不同石墨烯纳米材料的浓度、尺寸、表面结构和官能团等对石墨烯的生物毒性影响不同。

虽然，目前有关石墨烯哺乳动物毒性的研究已在逐步深入，但今后仍需对以下几个方面的研究进行探讨：一方面，纳米材料的代谢和排泄是长期过程，目前对纳米材料的毒性研究局限于短期毒性评估，石墨烯纳米材料在不同组织中的长期积累的毒性是未知的。因此，有必要使用不同的细胞和动物模型对石墨烯纳米材料的长期积累和排泄进行研究，以确保石墨烯在哺乳动物以及人类生物医学应用中的安全性。其次，石墨烯对生物体的影响主要是通过与生物大分子的相互作用实现的，目前尚缺乏石墨烯与DNA、蛋白质、酶等生物大分子相互作用方式和机制的研究。鉴于目前已经开展了石墨烯对人和小鼠等哺乳动物的毒性研究，今后石墨烯对植物等其他生物的毒性作用也应成为生物安全性评估的内容。

总之，石墨烯的的生物毒性取决于多方面的因素，哺乳动物接触石墨烯产生健康风险不容忽视，有关石墨烯的生物安全性研究有待加强。

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