郑炜炜 宋 革 吴 峥 刘善文 祝晓丽 谭玉梅

广东省计划生育专科医院生殖医学中心（广州，510060）

调查显示目前我国育龄夫妇中不孕不育夫妇比例约为10%～15%［1］，其中男性因素约30%～40%，而无精子症约占男性不育的7%～14%［2］。对于不可逆的无精子症患者合并女方不孕因素在经供精人工授精（AID）治疗无效后转诊行常规体外受精－胚胎移植（IVF－ET）的不在少数。已有大量文献研究了供精人工授精的精液质量标准，但供精精液用于常规体外授精的研究较少。授精时的精子浓度不仅影响受精率还可能影响胚胎的发育及妊娠的结局。本文旨在通过分析不同精子浓度和授精方式对受精、胚胎发育及妊娠结局的影响，探讨供精IVFET过程中授精时浓度适宜，为供精助孕受精方式的选择提供临床依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2013年1月－2016年6月在本院生殖医学中心行供精常规体外授精治疗的542周期和25个供精卵胞浆内单精子注射（ICSI）周期。供精IVF的适应证包括：①女方具有IVF指征同时其男性配偶为非梗阻性无精子症或男方染色体异常或有遗传性疾病者；②≥4次供精人工授精失败者。所有患者都有自发规律的月经周期（25～37d），体重指数（BMI）为18～25kg／m2，术前各常规检查结果均无异常；无染色体异常，无未治愈的子宫内膜疾病，排除子宫内膜异位症、内分泌系统、血液系统、风湿免疫系统以及其它全身性疾病。取卵周期获卵数≥5枚，卵子成熟度≥50%。

1.2 方法

1.2.1 控制性超排卵采用本中心常规短针长方案，用药包括：促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa，曲普瑞林，ERRING GmbH，德国）、卵泡刺激素（FSH，果纳芬，Merck Serono，瑞士／普丽康，Merck Sharp ＆DohmeLimited，英国）、人绒毛膜促性腺激素（hCG，艾泽，Merck Serono，瑞士）。阴道B超和激素测定监测卵泡生长，当1个优势卵泡直径≥18 mm或2个优势卵泡≥17mm时肌注hCG 250μg，36h后阴道B超引导下穿刺取卵。

1.2.2 精液来源及处理供精IVF（D－IVF）精液来源于广东省人类精子库、浙江省人类精子库及江西省人类精子库。冷冻精液37℃水浴复温5min，采用密度梯度离心加上游法获得活动精子，授精前计数精子密度、活动率等。

1.2.3 分组授精液用 Makler精子计数板进行计数。将患者按精子授精浓度不同分为A、B、C 3组。A组IVF时授精浓度为（1.0～＜2.0）×106／ml；B组精子授精浓度为（2.0～＜4.0）×106／ml；C组精子授精浓度为（4.0～8.0）×106／ml。

1.2.4 授精IVF：采用短时授精法，于hCG日后39～40h授精，精卵共同孵育2h后挑出卵母细胞，受精后16～18h脱颗粒细胞，观察受精情况。ICSI：取卵后3～4h将卵冠丘复合物置于80U／ml透明质酸酶溶液中消化吹打，去除卵丘颗粒细胞，选择已排出第一极体的成熟卵子待用，ICSI时间为hCG日后40～42h。

1.2.5 受精、胚胎评分采用Vitrolife G Plus系列序惯培养液，受精后16～18h观察原核形成，正常受精为2PN，D3［受精后（68±1）h］对胚胎进行形态学观察，包括胚胎细胞数目、大小、形状、胞浆形态、碎片和透明带的厚度及完整性等。胚胎分级［1］，1级：细胞大小均匀，形状规则，透明带完整，胞质均清晰，无颗粒现象，碎片＜5%。2级：细胞大小略不均匀，形状略不规则，胞质可有颗粒现象，碎片6%～20%。3级：细胞大小明显不均，可有明显的形状不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21%～50%。4级：细胞大小严重不均，胞质可有严重的颗粒现象，碎片＞50%。胚胎分级为1～2级的6～10细胞2PN来源胚胎视为优质胚胎，选择2枚用于移植或冷冻。

1.2.6 计算公式IVF受精率＝［1PN卵数＋2PN卵数＋（≥3PN卵数）＋晚期卵裂数］／获卵数×100%；ICSI 2PN受精率＝（2PN卵数／注射MII卵数）×100%；IVF多精受精率＝（≥3PN卵数／获卵数）×100%；卵裂率＝［1PN卵裂数＋2PN卵裂数＋（≥3PN卵裂数）＋晚期卵裂数］／［1PN受精数＋2PN受精数＋（≥3PN受精数）＋晚期卵裂数］×100%；优质胚胎率＝（优质胚胎数／2PN卵裂胚胎数×100%）；种植率＝（孕囊数／移植胚胎数）×100%；临床妊娠率＝（临床妊娠周期数／移植周期数）×100%。

1.2.7 临床妊娠结局观察胚胎移植后第14天尿、血hCG阳性者为生化妊娠；移植后4～6周B超见妊娠囊为临床妊娠。

1.3 统计学分析

计量资料以珚x±s表示，采用SPSS 21.0统计软件进行t检验和χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1一般临床资料

A、B、C 3组间女方年龄、不孕年限、基础FSH值、BMI、获卵数、平均移植胚胎数及供精精液参数包括精子密度、精子活动率等比较均无差异（P＞0.05），见表1。

表1 3组一般临床资料比较（珚x±s）

2.2 3组IVF－ET周期的结局比较

各组间受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率和流产率均无统计学差异（P＞0.05），但B组和C组的多精受精率高于A组（P＜0.05），见表2。

2.3 供精IVF和供精ICSI临床结局比较

将接受优化处理后供精精子浓度达1.0×106／ml助孕的患者分别行IVF和ICSI助孕。结果两种方式患者年龄、成熟卵子数、卵裂率、平均移植胚胎数均无统计学差异（P＞0.05）。ICSI组的2PN受精率高于IVF组（P＜0.05），但两组的优质胚胎率和临床妊娠率均无统计学差异（P＞0.05），见表3。

表2 3组IVF－ET结局比较

表3 不同授精方式对临床结局的影响（珚x±s）

3 讨论

人类辅助生殖技术中冷冻技术的迅猛发展，为男性不育患者带来了希望，尤其为无精子症或染色体异常患者提供了供精精源。辅助生殖技术管理规定无精子症患者的助孕治疗必须使用由国家卫生部批准的人类精子库提供的冷冻精液。虽然人类精子库采集的是经过严格筛查后合格人员的精液，但是经过低温冷冻保存后，仍会导致精子超微结构和顶体完整性发生变化。研究表明冷冻复苏过程影响精子DNA的完整性，导致解冻后精子活动率和精子洗涤处理后活动率的下降。冷冻解冻程序也对精子造成不可逆转的损伤，损害表现为精子体外授精能力降低［3－5］。关于供精精子在IVF中应用的研究较少，供精精子在IVF中合适的授精浓度少有报道。研究发现［6－8］，卵母细胞与高密度的精子长时间作用，精子代谢产生的多种有害物质如活性氧成分（ROS）、氧自由基等代谢产物会对卵子、胚胎乃至妊娠结局产生较大影响。目前有关人卵体外受精中最适精子浓度的研究报道较少，尚无统一规范，常规新鲜精液IVF授精时，精液浓度范围较广［（0.1～10）×106／ml］［9］，供精精液受精浓度更少有报道。本研究探讨供精精子授精时，是否能在更少的精子浓度下获得更多的优质胚胎，降低多精受精率，提高临床妊娠率。本研究随机将患者分为3组，比较不同授精浓度的受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率及流产率的差异，并与同期供精ICSI周期进行比较，结果显示低精子浓度组多精受精率明显低于高精子浓度的两组，3组间受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、流产率均无统计学差异，低精子浓度组临床妊娠率较高精子浓度两组虽无统计学差异，但有升高趋，这与大部分研究提示高浓度精子授精增加多精授精率，降低临床妊娠结局一致［8－9］。决定授精效果的因素很多，包括精子的浓度和精卵作用时间等，本研究采用短时授精的方法，即精卵共同孵育2h后，将卵母细胞从受精滴中挑出，减少了高浓度精子产生的代谢产物对胚胎发育的影响，所以在优质胚胎率、种植率和流产率上未见显著差异。

多精受精常见于IVF过程，授精精子数量的增多可导致卵细胞皮质颗粒释放延迟，导致较高频率的多精子受精，正常多精受精的比例约为1%～3%［10］，在本研究中授精浓度控制在（1.0～＜2.0）×106／ml时可获得正常的多精受精比例，在与高浓度精子授精组比较时显示并不降低受精率和胚胎质量，临床妊娠率也有提高，提示供精IVF过程中，精子授精浓度为（1.0～＜2.0）×106／ml是理想授精浓度。本研究比较了优化处理后精子浓度达1.0×106／ml的精液分别行常规IVF和ICSI授精的结局，结果发现在一般资料无差异的情况下，ICSI可提高2PN受精率，但并不提高胚胎质量、可利用胚胎率及临床妊娠率。从安全性的角度考虑笔者认为能够选择IVF授精就不必选择ICSI授精。

综上所述，供精IVF授精精子浓度为（1.0～＜2.0）×106／ml时其胚胎培养结果较为理想，受精率、多精受精率、优质胚胎率和临床妊娠率均在正常范围内，可作为供精授精时的加精浓度；在精液浓度可选择行IVF受精时，行ICSI助孕并不提高优质胚胎率和临床妊娠率。本研究是在本院生殖中心实验条件下对供精IVF授精浓度及授精方式选择进行的初步探索，由于各生殖中心的实验条件和供精质量各异，其结论可能有别于先前部分研究者的观点。同时，本研究为回顾性研究，下一步需要大样本的前瞻性研究证实本结论。

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