朱嫦琳，薛雄燕，陈展泽，谷愉愉，许扬扬，李炜煊

(1佛山市第一人民医院，广东佛山528000；2首都医科大学附属北京天坛医院)

血清HBcrAg、线性化HBsAg对隐匿性乙型肝炎的诊断价值

朱嫦琳1，薛雄燕1，陈展泽1，谷愉愉2，许扬扬1，李炜煊1

(1佛山市第一人民医院，广东佛山528000；2首都医科大学附属北京天坛医院)

目的 探讨血清乙肝病毒核心相关抗原(HBcrAg)及线性化乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对隐匿性乙型肝炎(OBI)的诊断价值。方法 选择OBI患者63例(OBI组)、体检健康者150例(对照组)，采用化学发光酶联免疫分析法检测两组血清HBcrAg、线性化HBsAg，采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析HBcrAg、线性化HBsAg二者单独及联合检测对OBI的诊断效能。结果 OBI组和对照组血清HBcrAg阳性率分别为90.5%和10.7%，线性化HBsAg阳性率分别为42.9%和6.0%，两组比较差异均有统计学意义(χ2分别为125.5、42.9，P均<0.05)。相关分析显示，HBV DNA与HBcrAg、HBV DNA、线性化HBsAg均呈正相关(R2分别为0.471 4、0.122 2、0.086 8，P<0.05或<0.01)。ROC曲线分析显示，血清HBcrAg、线性化HBsAg诊断OBI的曲线下面积(AUC)分别为0.911(95%CI为0.864～0.946)、0.683(95%CI为0.616～0.745)，二者联合检测诊断OBI的AUC为0.895(95%CI为0.846～0.933)，血清HBcrAg对OBI的诊断效能显著优于线性化HBsAg(Z=6.134，P<0.05)，二者联合检测并不能提高其对OBI的诊断效能(Z=0.657，P>0.05)。当血清HBcrAg、线性化HBsAg的最佳临界值分别为100 U/mL、0.48 IU/mL时，血清HBcrAg诊断OBI的敏感性显著高于线性化HBsAg(χ2=121.4，P<0.05)，特异性稍低于线性化HBsAg(χ2=3.034，P>0.05)，二者联合检测诊断OBI的敏感性和特异性较单独检测HBcrAg并未明显提高(χ2分别为1.322、3.802，P均>0.05)。结论 血清HBcrAg与HBV DNA存在良好的相关性，对OBI的诊断效能优于线性化HBsAg，但联合检测HBcrAg、线性化HBsAg并不能提高其诊断效能；血清HBcrAg可单独作为诊断OBI的血清学指标。

隐匿性乙型肝炎；乙肝病毒核心相关抗原；线性化乙型肝炎病毒表面抗原

隐匿性乙型肝炎(OBI)是乙肝病毒(HBV)感染的一种特殊形式，表现为乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阴性而HBV DNA阳性[1]。OBI可通过垂直传播、输血、器官移植等途径传播病毒，且与慢性肝病、肝癌等发生、发展密切相关[2，3]。由于一般血清HBV标志物不能有效检出OBI[4]，目前诊断OBI时需采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA[5]，基层医院无法开展。乙肝病毒核心相关抗原(HBcrAg)包含乙肝病毒核心抗原(HBcAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和p22cr蛋白，与肝组织cccDNA含量、HBV DNA具有良好的相关性[6]。线性化HBsAg是经过理化因素处理HBsAg，使其结构发生改变，内部隐藏的抗原表位被暴露，可提高HBV检出率[7]。本研究探讨血清HBcrAg、线性化HBsAg对OBI的诊断价值，旨在为OBI诊断提供更便捷的方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年3月～2015年12月佛山市第一人民医院收治的OBI患者63例(OBI组)。均符合OBI诊断标准，即HBsAg阴性、HBV DNA阳性。排除合并急慢性肝炎、肝硬化、肝癌及其他肝脏疾病者。其中，男37例、女26例，年龄19～63(33.2±13.1)岁。同期选择在该院体检的健康者150例(对照组)，男92例、女58例，年龄18～65(34.6±12.9)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 血清HBcrAg、线性化HBsAg检测 所有研究对象清晨空腹采集肘静脉血4～5 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存待测。血清HBcrAg、线性化HBsAg检测采用LUMIPULSE G1200型全自动化学发光免疫分析系统及配套试剂，血清HBV DNA检测采用ABI公司7300型实时荧光定量PCR仪。所有操作严格按试剂盒说明书进行。结果判定：HBcrAg>100 U/mL为阳性，线性化HBsAg>5 IU/mL为阳性，HBV DNA>500 copies/mL为阳性；计算HBcrAg及线性化HBsAg阳性率，并分析HBV DNA、HBcrAg及线性化HBsAg之间的关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析HBcrAg和线性化HBsAg对OBI的诊断效能，并确定最佳临界值(cut-off值)，ROC曲线下面积(AUC)比较采用Hanley和McNeilZ检验。ROC曲线分析采用MedCalc15.2.2软件。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清HBcrAg及线性化HBsAg阳性率比较 OBI组和对照组血清HBcrAg阳性率分别为90.5%(57/63)、10.7%(16/150)，线性化HBsAg阳性率分别为42.9%(27/63)、6.0%(9/150)。两组HBcrAg、线性化HBsAg阳性率比较差异均有统计学意义(χ2分别为125.5、42.9，P均<0.01)。

2.2 HBV DNA、HBcrAg及线性化HBsAg的关系 HBV DNA与HBcrAg经对数转换后，Spearman等级相关分析显示，所有研究对象HBV DNA与HBcrAg、线性化HBsAg均呈正相关关系(R2分别为0.471 4、0.122 2，P均<0.01)，HBcrAg与线性化HBsAg亦呈正相关关系(R2=0.086 8，P<0.01)。见图1。

图1 HBV DNA、HBcrAg及线性化HBsAg的关系

2.3 血清HBcrAg及线性化HBsAg的ROC曲线分析 血清HBcrAg、线性化HBsAg及二者联合检测诊断OBI的ROC曲线见图2。血清HBcrAg诊断OBI的AUC为0.911(95%CI为0.864～0.946)，线性化HBsAg诊断OBI的AUC为0.683(95%CI为0.616～0.745)，二者联合检测诊断OBI的AUC为0.895(95%CI为0.846～0.933)，血清HBcrAg对OBI的诊断效能明显高于线性化HBsAg(Z=6.134，P<0.01)，二者联合检测并不能提高其对OBI的诊断效能(Z=0.657，P>0.05)。以血清HBcrAg、线性化HBsAg的最佳临界值(cut-off值)分别为100 U/mL、0.48 IU/mL时，血清HBcrAg诊断OBI的敏感性、特异性分别为91.94%、89.40%，线性化HBsAg诊断OBI的敏感性、特异性分别为41.94%、94.04%，二者联合检测的敏感性、特异性分别为88.71%、82.72%。血清HBcrAg诊断OBI的敏感性高于线性化HBsAg(χ2=121.4，P<0.01)，但特异性稍低于线性化HBsAg(χ2=3.034，P>0.05)；二者联合检测诊断OBI的敏感性和特异性并未比单独检测HBcrAg有所提高(χ2分别为1.322、3.802，P均>0.05)。

图2 血清HBcrAg、线性化HBsAg及二者联合检测诊断OBI的ROC曲线分析

3 讨论

据统计，全世界约1/3的人群存在既往感染HBV证据，其中超过1/3的HBV携带者来自我国，是我国急慢性肝炎、肝硬化和肝癌等患者人数众多的主要原因之一[8]。OBI是HBV感染的一种特殊形式，表现为血清HBV DNA阳性、HBsAg阴性，可伴有或不伴有anti-HBc阳性，是HBV通过输血传播的重要原因之一。OBI的感染率与HBV流行率密切相关。据统计，我国HBsAg阳性率高达7.2%，HBV DNA阳性率亦逐年递增[9，10]。HBsAg的高流行状态提示OBI感染率可能较高。前期研究发现，HBsAg阴性而anti-HBc阳性的人群中，HBV DNA的阳性率高达70.4%[11]；广州血液中心调查发现，筛检HBsAg阳性后，OBI的发生风险仍有0.061%[12]；深圳市血液中心对无偿献血者标本进行HBV DNA筛查发现，初次献血者OBI发生率达0.105%[13]。以上结果提示，OBI在我国并不少见。OBI患者以现有的HBsAg检测方法结果均为阴性，但肝脏中存在HBV DNA复制，血清中也能检测到HBV DNA，极有可能发生HBV感染，是导致经HBsAg筛查后仍有HBV传播风险的主要原因之一[14,15]。此外，在实际临床工作中，HBsAg筛查为阴性者多不进行HBV DNA定量检查，导致OBI漏诊。

血清HBcrAg并非一种蛋白，其主要包含HBcAg、HBeAg和p22cr蛋白，这3种蛋白共享149个由前C/C区编码的氨基酸序列，其中p22cr蛋白常存在于HBV DNA阴性的病毒颗粒中。有研究发现，血清HBcrAg水平与肝组织cccDNA、HBV DNA及其他病毒学标志物均具有良好的相关性，可用于评价乙肝患者病情和患者肝组织学状态[16,17]。HBcrAg最初的检测方法为酶联免疫分析法，其与PCR法检测HBV DNA具有相似的敏感性[18]。目前检测HBcrAg最常用的方法为化学发光酶联免疫分析法，即使用单克隆抗体制成固相抗体，用另一株单克隆抗体标记辣根过氧化物酶作为酶标抗体，利用双抗体夹心原理，通过测定发光强度计算样品中HBcrAg的含量[19]，由于不受anti-HBc、anti-HBe和前C区突变的影响，敏感性和特异性均较高，且检测为全自动化，无需专用实验室和专人操作[20]。线性化HBsAg是经过理化因素处理过的HBsAg。传统HBsAg检测方法所用抗体主要针对的抗原表位可能发生突变而导致检测结果假阴性。线性化HBsAg检测时，样本通过变性处理，使其结构发生改变，原来隐藏在内部的抗原表位被暴露，采用针对这些表位的单抗复合物作为检测抗体，可大大提高HBV的检出率。有研究发现，线性化HBsAg与传统HBsAg具有良好的相关性，可检测经抗病毒治疗患者血清中的HBsAg，且敏感性比传统方法提高10倍以上[21]。因此，线性化HBsAg检测可作为因病毒变异或受HBsAg检测方法限制，而导致无法进行OBI检测的良好补充手段。

本研究结果发现，OBI组血清HBcrAg、线性化HBsAg阳性率均高于对照组，其中血清HBcrAg阳性率高达90.5%，表明血清HBcrAg对OBI诊断有较强的提示作用。由于受方法学限制，OBI患者血清HBsAg未能通过现有方法有效检出，可能造成临床上漏诊，而HBcrAg检测可对其有效补充，大大提高OBI的检出率。本研究还发现，血清HBV DNA、HBcrAg、线性化HBsAg三者两两均呈正相关关系，但HBcrAg与HBV DNA相关性更高。由于本研究纳入的研究对象均未发生过急慢性肝炎且未经过任何抗肝炎治疗，因此认为，在自然状态下HBcrAg与HBV DNA相关性良好，可反映血清HBV DNA水平，与文献[20，22]报道基本一致。提示在开展HBV DNA检测条件不足时，血清HBcrAg可作为较理想的替代手段。ROC曲线分析显示，血清HBcrAg对OBI的诊断效能显著优于线性化HBsAg，二者联合检测并不能提高其对OBI的诊断效能，以血清HBcrAg的cut-off值为100 U/mL时，其诊断OBI的敏感性和特异性分别达到91.94%、89.40%，故临床上可单独用血清HBcrAg水平诊断OBI，而单独或同时检测血清线性化HBsAg对OBI的诊断价值不大。

综上所述，血清HBcrAg在自然状态下与HBV DNA存在良好的相关性，由于其检测操作简便，干扰因素少，敏感性和特异性高，无需专用实验室和专人操作等，可在无法开展HBV DNA检测时作为替代检测。血清HBcrAg对OBI的诊断效能较好，可单独作为诊断OBI的血清学指标。由于本研究纳入样本量较少、样本类型略有不足等，其结论仍需更多大样本、多中心的研究数据进一步验证。

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Diagnostic value of serum HBcrAg and linearized HBsAg for occult hepatitis B virus infection

ZHUChanglin1,XUEXiongyan,CHENZhanze,GUYuyu,XUYangyang,LIWeixuan

(1TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528000,China)

Objective To investigate the value of serum hepatitis B virus core-related antigens (HBcrAg) and linearized hepatitis B surface antigen (HBsAg) in diagnosis of occult hepatitis B virus infection (OBI) in Chinese population. Methods HBcrAg and linearized HBsAg levels were measured by chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) in 63 patients with OBI (OBI group) and 150 healthy people (control group). The serum HBV DNA was detected by fluorescence quantitative PCR. Receiver operating characteristics (ROC) was analyzed to calculate diagnostic accuracy of HBcrAg and combination with linearized HBsAg. Results Serum HBcrAg and linearized HBsAg were detected in 90.5% and 42.9% of the OBI group, and 10.7%, 6.0% of the control group, respectively (χ2=125.5, 42.9, allP<0.05). There were positive correlation between HBV DNA and HBcrAg, HBV DNA and linearized HBsAg, HBcrAg and linearized HBsAg, respectively (R2=0.471 4, 0.122 2, 0.086 8,P<0.05 orP<0.01). HBcrAg had better area under the ROC curves (AUC) [0.911 (95%CI: 0.864-0.946)] than linearized HBsAg [0.683 (95%CI: 0.616-0.745),Z=6.134,P<0.05]. The AUC of combined detection was 0.895 (95%CI: 0.846-0.933), and no significant improvement was found (Z=0.657,P>0.05). The optimal HBcrAg and linearized HBsAg cutoff values were 100 U/mL and 0.48 IU/mL, respectively. The sensitivity of HBcrAg in diagnosis of OBI was significantly higher than that of linearized HBsAg (χ2=121.4,P<0.01), while specificity was a little lower (χ2=3.034,P>0.05). Combined detection in diagnosis of OBI did not show any improvement than single detection of HBcrAg or linearized HBsAg in sensitivity or specificity (χ2=1.322, 3.802, allP>0.05). Conclusion There is a good correlation between serum HBcrAg and HBV DNA, and HBcrAg is more sensitive than linearized HBsAg or combined detection in diagnosis of OBI, which can be used as a good serological marker for the diagnosis of OBI.

occult hepatitis B virus infection; Hepatitis B virus core-related antigens; linearized hepatitis B surface antigen

广东省医学科研基金立项项目(B2015127)。

朱嫦琳(1985-)，女，主管技师，研究方向为免疫学与分子生物学。E-mail： changlin_zhu@126.com

李炜煊(1960-)，男，主任技师，研究方向为生化免疫学。E-mail： lwx21cn@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.003

R512.6

A

1002-266X(2017)08-0009-04

2016-07-07)