张红波，莫尚鹏，陈玉红，罗 维，熊英，李建雄，徐 烨

(1、宜春市疾病预防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民医院，江西宜春336000)

宜春市2011年至2012年乙型流感病毒耐药基因分析

张红波1，莫尚鹏1，陈玉红1，罗 维1，熊英2，李建雄2，徐 烨3

(1、宜春市疾病预防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民医院，江西宜春336000)

目的分析宜春市2011~2012年B型流感病毒耐药基因位点，掌握其耐药情况，为临床治疗和疾病控制提供依据。方法采集宜春市流感监测医院和疑似流感疫情的流感样病例鼻咽拭子标本进行流感病毒分离，选择分离到的16株B型流感病毒进行核酸提取，采用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒NA基因后进行基因序列测定，用DNAStar5.0，Mage3.1生物软件对测序结果进行分析处理，翻译出氨基酸序列，进行基因特性分析。结果16株B型流感病毒NA区域核苷酸序列长度均为1140bp，编码380个氨基酸，所有毒株的NA蛋白催化活性位点和辅助位点均未发生氨基酸替换。结论16株毒株均对流感病毒神经氨酸酶抑制剂药物敏感，我们应该继续对流行株耐药情况进行检测。

B型流感病毒；耐药性；NA基因

流行性感冒（influenza，简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：全身疼痛、急起高热、乏力显著和轻度呼吸道症状。乙型流行性感冒病毒是引起流感的主要病原之一，目前临床上用于治疗乙型流感的药物仅限于神经氨酸酶抑制剂类的药物。本研究分析了我市2011至2012年B型流感病毒神经氨酸酶基因特征以及特异性耐药位点，从分子水平研究我市B型流感的耐药性特点，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源采集宜春市流感监测哨点医院流感样病例或者流感疫情病例咽拭子标本。

1.2 病毒分离采用狗肾传代细胞进行病毒分离，

根据细胞病变结合微量血凝实验（HA）来判断是否有病毒存在。将HA≥1：8的标本采用血凝抑制方法（HI）进行流感病毒型别鉴定（MDCK和标准血清均由国家流感中心提供）。所有被研究毒株均经国家疾控流感中心复核（所有毒株的毒株号均下载于国家流感监测网站）。

1.3 病毒选择随机选择不同时间、不同监测医院监测标本或疫情咽拭子标本中分离到的B型流感病毒，共16株病毒进行基因扩增和测序。

1.4 病毒RNA提取采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂对流感病毒细胞培养液进行核酸提取。

1.5 引物

NA-5’[2]BNAF GCAGAAGCAGAGCATATTCTTAG BNAR ATGGACAAATCCTCCCTTGATGC

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

1.6 RT-PCR扩增NA基因采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒进行RT-PCR反应，反应条件[4]：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循环如下：94℃40s，50℃40s，72℃1min 30s，35次循环，72℃10min。

1.7 核苷酸序列测定PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸双向测定。

1.8 序列分析采用DNAStar5.0、Mage5.0分析软件对NA-5’和NA-3’扩增的产物测序后核苷酸进行拼接、同时分析核苷酸和氨基酸的同源性，以B/ Beijing/1/1997的NA基因序列作为参照分析，收录号为M54967。

2 结果

2.1 基因核苷酸同源性及遗传进化分析16株病毒核酸经NA5’和NA3’引物扩增后产物经纯化、双向测序、序列拼接后，均获得1140bp核苷酸，编码380个氨基酸。经上述软件分析，与B/Beijing/1/ 1997进行比对，核苷酸同源性在93.7%～94.8%之间、氨基酸的同源性在92.5%～94.0%之间。在NA基因氨基酸序列的进化树（图1）上可见我市16株病毒同一分支上，但是这一分支又分为2个小分支，其中1个分支是是Yamagata系，另1个分支是Victoria系。

图1 NA基因氨基酸进化树

2.2 NA基因耐药性位点分析根据测序的核苷酸序列推导出NA基因的氨基酸序列（图2），对NA基因各个酶催化活性位点（B Numbering）（R-116、D-149、R-150、R-223、E-275、R-292、R374）氨基酸、辅助位点（E-117、R-154、W-177、S-178、D-197、I-221、E-226、H-273、E-276和N-294位）氨基酸进行分析，16株毒株全部未发生替换。对G141、N144、S249、T325、R374等其他位点进行突变分析，也未发现氨基酸替换的现象。

3 讨论

乙型流感一直以来都是困扰我们的日常疾病之一，近年来的一些监测及流行病学数据均显示乙型流感病毒所带来流行和死亡的疾病负担远远高于人们的传统认识。有研究发现乙型流感病毒平均发病到死亡的时间仅仅为3d，短于任何一次流感大流行时期的病例发病到死亡的时间，另外目前国内某些药物的不规范使用也是一个原因，人们应对乙型流感病毒予以更多的重视及关注。

从我市近年流感病毒分离情况来看，主要为甲型流感病毒，同时出现少量乙型流感病毒[7]，乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系共同流行。乙型流感的治疗主要依赖于神经氨酸酶抑制剂（NAIs），病毒神经氨酸酶为药物作用靶点，不仅因为病毒神经氨酸酶在病毒传播流行中发挥着重要作用，而且神经氨酸酶的酶催化活性位点氨基酸及周围的辅助位点氨基酸及其保守。流感病毒神经氨酸酶主要的七个氨基酸（N2 Numbering）（R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371）作为酶催化活性位点直接作用于底物或作为维持其功能的重要因素，而其他十个氨基酸（E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、1-222、E-227、H-274、E-277、N-294）作为辅助位点，神经氨酸酶抑制剂作用于其催化活性位点或者辅助位点[10]，可以有效阻断流感病毒的感染、复制及传播过程。人们对于NA抑制剂的耐药性的研究大多数集中在甲型流感病毒，而对于乙型流感病毒相关研究进行的较少，尽管甲型流感病毒和乙型流感病毒神经氨酸酶序列是不同的（一致情况仅20%~30%），但它们的活化位点的残基及三维结构是保守的，因此神经氨酸酶抑制剂的作用机制是相同的。

距今美国FDA批准的NAIs有Oseltamivir和Zanamivir，Oseltamivir2002年在我国注册，随着NAIs临床的使用，将不可避免的出现耐药株。Gubareva LV[12]等1998年报道从免疫功能低下的儿童标本中分离到在神经氨酶酶活性位点R152K（N2 numbering）突变的对Zanamivir耐药的乙型流感病毒；之后许多研究人员从临床研究中发现分离自NAIs治疗的病人标本的流感病毒出现D198N、I222T、H274Y、N294S位点以及E105K、G109E、E110K、S250G、G402S等其他位点的突变[13-15]，而一些监测研究[16，17]也发现了流感病毒R371K、I222T、H274Y、D198E、D198Y、I222T/V位点以及R325I、G142R、N146K等其他位点的突变；而体外药敏实验研究[18-20]发现了流感病毒R152K、R292K、E119A、E119D、E119G、E119V、D198N、

I222T位点的突变会导致对NAIs的敏感性降低。这些研究都提示乙型流感NA的耐药位点的多样性和耐药病毒株越来越多的涌现，我国在2010～2011年已经发现了4株对Oseltamivir耐药的I222T突变株，以及1株对Oseltamivir和Zanamivir耐药的D198N突变株[20]。

虽然本次研究尚未发现NA基因耐药位点的变异，为了我市人民的身体健康，乙型流感的耐药监测必须长期开展下去，也为我市流感的预防和控制提供数据支持。

图2 NA蛋白氨基酸序列

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Analysis of drug resistance gene in influenza B virus in Yichun from 2011 to 2012

ZHANG Hongbo，MO Shangpeng，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention of Yichun City，Yichun Jiangxi 336000，China.

Objective To understand the molecular characterization of neuraminidase(NA)genes and NA drug resistance of influenza B virus in YiChun from 2011 to 2012.Methods The specimens of nasopharyngeal swabs were collected from influenza like cases of monitor hospitals and influenza epidemic situation.16 strains of influenza B virus were randomly selected for detection and extract virus RNA from the specimens.Fragments of NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained were analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage3.1.Results The nucleotides of NA gene of 16 strains were all 1140bp which encoded 380 amino acids.All strains had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene.Conclusions All virus were sensitive to neuraminidase inhibitors，however continuous resistance surveillance is necessary for control and prevention influenza.

Influenza B virus；Resistance；NA gene

R446.5，Q939.92，R373.1+3

A

1674-1129(2017)01-0049-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.015

2016-07-22；

2017-01-11)

张红波，1984年生，男，学士学位，主管技师，主要从事微生物及病毒的实验室监测工作

徐烨，1985年生，女，学士学位，主管技师，主要从事临床分子分型检测工作。E-mail：233270758@qq.com