张广超 周华成

氢气对移植肺损伤保护作用的研究进展

张广超 周华成

肺移植是治疗终末期肺疾病的最终方案，但肺移植的成功率和长期存活率比较低，3月、1年和5年的生存率分别是82%、78%和49%[1]。肺移植过程会经历缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)、免疫排斥反应等一系列病理生理变化，引起肺损伤，造成原发性移植物功能不全(primary graft dysfunction, PGD)。移植后72h严重PGD的发生率高达30%，与受体的病死率紧密相关[2]。临床上急需缓解移植肺IRI，改善移植后短、长期各项指标的治疗方案。作为一种抗氧化剂，氢气早已作为治疗性气体应用于临床。以往的文献已证明氢气对多种疾病具有较显著的治疗作用。一些动物实验表明氢气可减轻多种原因诱发的肺损伤包括移植肺损伤，发挥保护作用。

一、氢气的物理特性

氢气是一种化学性质活跃的小分子物质，在自然界中广泛分布，空气中其浓度为0.00006%[3]。氢气是无毒性气体，不溶于水，在浓度小于4%时，无燃烧和爆炸风险。生理状态下，人体肠道菌群可产生大量的氢气，参与人体部分生理过程，最终由肺脏排出或代谢生成无毒性的水。在人体内活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)如羟自由基(·OH)、过氧化硝酸阴离子(ONOO-)、H2O2等不断产生，可与核质、脂质、蛋白质等正常细胞构成物质反应，破坏正常结构和功能。同时，部分ROS还可参与人体正常生理生化过程。由于氢气较强的还原特性，可作为抗氧化剂，在不影响其正常生理功能情况下选择性消除ROS的毒性作用。作为小分子气体，氢气可依靠浓度梯度直接穿过细胞膜和亚细胞器膜，弥散至胞浆和细胞器中，从而快速作用于靶点。目前，氢气的应用方式主要有氢气吸入、腹腔注射饱和氢气盐水、口服富氢水、氢气浴等。而肺脏独特的结构特点，可使其不经过血液循环直接进行气体交换，这就使氢气在肺移植供体保存期时也能发挥保护作用。

二、氢气应用于肺损伤保护的概况

全身性炎症反应、氧化应激或机械刺激等原因均可诱发急性肺损伤，氢气可以通过其抗氧化、抗炎症、抗凋亡等生理特性改善肺损伤程度，减缓肺损伤病程进展，保护肺脏功能。

Huang CS和Wu Q等发现吸入2%氢气可发挥抗炎症、抗凋亡和抗氧化的作用，减轻机械通气性肺损伤[4-5]。Sun Q和Kawamura等发现2%氢气可以减轻炎症反应，氧化应激和细胞凋亡，改善高氧肺损伤的肺脏氧合功能[6-7]。Terasaki Y[8]等发现氢气通过消除ROS的毒性作用对放射性肺损伤发挥保护作用。Qiu X、Xie K、Zhang Y[9-11]等人的研究发现氢气可通过减轻炎症应激，减少凋亡来治疗大鼠内毒素引起急性肺功能障碍。Fang Y[12]等研究发现，腹腔注射富氢水可减轻肺脏炎症反应，改善大面积烫伤大鼠模型肺脏氧化损伤。Zhai Y[13]等人探究发现氢气饱和盐水腹腔注射可抗氧化，抗炎症，减轻肠道相关性的肺损伤。Li H[14]等人研究发现腹腔注射富氢水可改善氧化应激，减轻炎症反应，从而减轻缺血再灌注引起的肺损伤。此外，还有研究证明，氢气对农药中毒、休克复苏、CO中毒引起的肺损伤也具有一定的保护作用。

三、氢气应用于移植肺损伤保护

近几年，关于氢气应用于肺移植过程肺功能保护的研究开始兴起，氢气对肺移植肺损伤的保护作用被证实。移植肺在保存期氢气预处理或在移植过程中和移植后应用均被证明可以减轻肺损伤，改善肺功能。

1. 氢气对供体肺损伤的保护作用

2011年Kawamura[15]等人在肺移植物切取前使用氢气机械通气，冷保存后进行了相关指标的检测。结果发现相对于对照组，实验组肺组织前炎性细胞活素TNF-α和IL-1β的mRNA表达下调；Bcl-2表达增多，Bax表达下降；抗氧化酶血红素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)的产生增加；肺脏氧合功能，病理评分显著改善。结果证明氢气可通过减轻炎症反应，抗氧化应激，抗凋亡发挥供体肺保护作用，其中HO-1分子的产生增多是一个较为重要的保护机制。2012年Tanaka[16]等通过基因水平的研究证明，肺供体切取前2% 氢气机械通气可以使肺组织中肺表面活性物质相关分子、ATP合成酶类和应激反应分子相关基因(丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系统等)为主的229个目标基因发生显著改变，发挥抗炎症，抗凋亡，抗氧化作用，改善气体交换功能。2015年Haam S[17]等人建造了猪的心脏骤停后肺脏热缺血模型，并使用氢气对离体肺脏供体进行机械通气。结果发现IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达水平下降，炎症反应减轻。尽管实验组和对照组MAPK相关酶系的表达没有明显统计学差异，但是相比对照组实验组p38、JNK、ERK相关的磷酸化作用有所降低。

2. 氢气对受体肺损伤的保护作用

2010年Kawamura等人[18]研究发现大鼠原位左肺移植过程中及再灌注后吸入2%氢气，均可以显著改善气体交换功能，降低移植肺组织丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)，抑制脂质过氧化，减少促炎介质如ICAM-1、TNF-α和IL-6等的产生和释放，调节Bcl-2/Bax的表达水平。说明氢气通过抗氧化，抗炎症和抗凋亡作用，减轻移植肺缺血再灌注损伤。2013年周华成[20]课题组发现供体肺移植前后使用2% 氢气机械通气可以改善移植肺的氧合，降低肺损伤评分；降低IL-8、ICAM-1、TNF-α的水平；减少MDA和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的产生，促使超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)产生增加；降低细胞凋亡指数，抑制Caspase-3的表达。证实氢气可以通过抗炎症，抗氧化，抗凋亡机制对脑死亡供体肺移植肺脏功能发挥保护作用。2014年Noda K[19]课题组发现体外肺灌注期间使用氢气机械通气预处理可使移植后肺组织血红素加氧酶HO-1水平上调，移植肺炎症改变减轻，线粒体生物发生增强，乳酸盐的产生减少，低氧诱导因子-1的表达下降。从而改善移植肺功能，发挥移植肺的保护作用。2015年周华成[20]课题组在冷缺血期使用首创的氢气膨肺方法进行供体保护研究，结果发现冷缺血期氢气膨肺可减轻移植肺的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。从而改善肺氧合功能，发挥移植肺保护作用。2016年周华成[21]课题组探究了冷缺血期单纯使用氢气或CO，以及两者联合应用对移植肺缺血再灌注损伤的影响，结果发现相对于对照组，实验组移植后氧合功能改善、病理评分显著改善，压力容积曲线升高，MPO和MDA含量降低，SOD产生增多，炎症因子IL-8、TNF-α产生下降。说明氢气及CO，或两者联合使用能够通过抗氧化、抗炎症、抗凋亡来保护移植肺功能。

综上所述，氢气可通过抗氧化应激、抗炎症、抗凋亡效应、调节相关基因表达和一些特殊的分子通路对移植肺损伤发挥保护作用。具体的保护机制如下：

四、氢气对移植肺损伤的可能保护机制

1. 抗氧化作用

·OH和ONOO-是对肺组织影响最大的氧自由基，氢气可以选择性的清除·OH、ONOO-等氧自由基，使其还原成无毒性的水。氢气可使组织内SOD，以及线粒体内过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，Gpx)等抗氧化物的表达水平升高。因此，氢气可以抑制ROS对线粒体膜的损伤，减少细胞色素C的释放，以免线粒体为中心的细胞凋亡途径启动。氢气可以降低脂质过氧化水平，减少MDA的产生，减少生物膜的损伤。防止生物膜如细胞膜和细胞器膜的通透性过高，保护细胞稳态[20,22-23]。

2.抗炎症作用

TNF-α、IL-1β和IL-6在炎症的级联放大效应中发挥了重要作用，是介导炎症反应的最重要的炎症因子。氢气可显著抑制损伤肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1的mRNA表达，同时可使IL-10的水平上调，来协同发挥抗炎症作用。氢气还可以减少MPO的活性，说明氢气可以减少中性粒细胞的聚集。同时，病理分析发现，氢气处理的损伤肺组织炎症细胞的聚集较少，组织水肿程度轻[6,20,24]。

3. 抗凋亡作用

氢气可使ROS的产生下降，抑制线粒体为中心的内源性细胞凋亡途径；还可减少炎症介质如TNF-α的表达，抑制外源性细胞凋亡途径。氢气可使凋亡基因caspase-3、caspase-8、bax的表达水平明显下调，同时，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的表达水平明显上调。由此可抑制促凋亡蛋白的表达，促进抗凋亡蛋白的产生，从而降低蛋白酶的分泌，保护细胞的完整性不受破坏，抑制细胞凋亡程序的启动[9,15,24]。

4. 保护线粒体结构和功能

氧化应激和炎症应激产生的ROS和TNF-α都可以激活线粒体为中心的细胞凋亡过程。氢气可降低线粒体内MDA的水平，使GSH水平升高，还可增强SOD、CAT、Gpx的活性，减轻线粒体的脂质过氧化，增强线粒体抗氧化能力，维持线粒体氧化还原反应平衡。氢气可以选择性清除ROS，减轻氧化应激。下调炎症因子表达和释放。从而保护线粒体结构和功能的完整，减少细胞色素C的释放，抑制线粒体为中心的凋亡过程。另外，氢气还可以保护线粒体的呼吸功能，减少ATP的消耗[22]。

5. 特殊信号传导通路

(1) Nrf2/HO-1 2010年Kawamura T[18]等首次提出氢气可诱导HO-1表达增多,从而降低肺水肿、炎症因子的表达以及细胞凋亡等，是氢气发挥抗LIRI的机制之一。2013年，该课题组发现氢气通过核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)调节肺组织中HO-1基因的表达[6]。

(2) NF-κB/Bcl-2 2011年Huang[4]等对机械肺损伤模型氢气吸入治疗后发现，NF-κB的表达在1h时达到高峰，与此同时抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显上升，而Bax的水平相应下降。给予NF-κB抑制剂后，Bcl-2的水平下降，而Bax的水平上升。因此Huang等人认为NF-κB/Bcl-2是氢气发挥保护作用的一个重要通路。

(3) ROS-JNK-Caspase-3 Qiu[10]等发现氢气可以抑制内毒素引起肺损伤肺组织ROS的产生，降低MDA和NT的水平，抑制MPO的活性，保护SOD的功能，抑制p-JNK的激活。氢气还可逆转下游的Bax和Caspase-3的升高以及Bcl-xl水平的下降。氢气可能通过ROS-JNK-Caspase-3信号通路对肺损伤发挥保护作用。

(4) TNF-α/NF-κB 2012年Xie[11]等发现氢气可抑制NF-κB的活化，抑制Caspase-3的活性，还可下调促炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子的表达，从而减少细胞凋亡，减轻组织炎症细胞聚集和炎症反应。2015年Wu[5]等人对单肺通气肺损伤模型进行氢气治疗，结果同样发现NF-κB的水平明显下降，TNF-α、IL-1β、IL-6的表达下降。

(5) p38 MAPK/TNF-α 2012年Liang C[25]等人应用氢气预处理来治疗内毒素引起的急性肺损伤，结果发现氢气吸入可以有效抑制p38MAPK的激活，从而减少其下游TNF-α的释放，由此减少肺组织炎症细胞的浸润，减轻肺组织损伤，保护肺功能。

总之，氢气作为小分子气体，可以穿透生物膜来发挥抗氧化、抗炎症、抗凋亡作用，还可通过调节一些特殊分子信号传导通路，发挥移植肺供体保护作用。现如今，氢气对肺移植肺损伤的保护机制仍然不甚明了，还需要进一步的研究。目前的研究还仅限于移植后短时间的观察和分析，尚缺乏长期的研究。氢气对肺移植肺损伤保护作用的研究还停留在小型动物如大鼠、兔试验阶段，欲应用于大型动物和临床尚有较长的一段路要走。

[1] Corris PA, Christie JD. Update in transplantation 2006[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007,175(5):432-435.

[2] Porteous MK, Diamond JM, Christie J D. Primary graft dysfunction: lessons learned about the first 72 h after lung transplantation[J]. Curr Opin Organ Transplant, 2015,20(5):506-514.

[3] Zheng XF, Sun XJ, Xia ZF. Hydrogen resuscitation, a new cytoprotective approach[J]. Clin Exp Pharm Phys, 2011,38(3):155-163.

[4] Huang C, Kawamura T, Peng X, et al. Hydrogen inhalation reduced epithelial apoptosis in ventilator-induced lung injury via a mechanism involving nuclear factor-kappa B activation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,408(2):253-258.

[5] Wu Q, Zhang J, Wan Y, et al. Hydrogen water alleviates lung injury induced by one-lung ventilation[J]. J Surg Res, 2015,199(2):664-670.

[6] Kawamura T, Wakabayashi N, Shigemura N, et al. Hydrogen gas reduces hyperoxic lung injury via the Nrf2 pathway in vivo[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2013,304(10):L646-656.

[7] Sun Q, Cai J, Liu S, et al. Hydrogen-Rich Saline Provides Protection Against Hyperoxic Lung Injury[J]. J Surg Res, 2011,165(1):e43-49.

[8] Terasaki Y, Ohsawa I, Terasaki M, et al. Hydrogen therapy attenuates irradiation-induced lung damage by reducing oxidative stress[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2011,301(4):L415-426.

[9] Zhang Y, Liu Y, Zhang J. Saturated hydrogen saline attenuates endotoxin-induced lung dysfunction[J]. J Surg Res, 2015,198(1):41-49.

[10] Qiu X, Li H, Tang H, et al. Hydrogen inhalation ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Int Immunopharmacol, 2011,11(12):2130-2137.

[11] Xie K, Yu Y, Huang Y, et al. Molecular Hydrogen Ameliorates Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury in Mice through Reducing Inflammation and Apoptosis[J]. Shock, 2012,37(5):1-38.

[12] Fang Y, Fu XJ, Gu C, et al. Hydrogen-rich saline protectsagainst acute lung injury induced by extensive burn in rat model[J]. J Burn Care Res, 2011,32(3):e82-91.

[13] Zhai Y, Zhou X, Dai Q, et al. Hydrogen-rich saline ameliorates lung injury associated with cecal ligation and puncture-induced sepsis in rats[J]. Exp Mol Pathol, 2015,98(2):268-276.

[14] Li H, Zhou R, Liu J, et al. Hydrogen-rich saline attenuates lung ischemia-reperfusion injury in rabbits[J]. J Surg Res, 2012,174(1):e11-16.

[15] Kawamura T, Huang C, Peng X, et al. The effect of donor treatment with hydrogen on lung allograft function in rats[J]. Surgery, 2011,150(2):240-249.

[16] Tanaka Y, Shigemura N, Kawamura T, et al. Profiling molecular changes induced by hydrogen treatment of lung allografts prior to procurement[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012,425(4):873-879.

[17] Haam S, Lee S, Paik HC, et al. The effects of hydrogen gas inhalation during ex vivo lung perfusion on donor lungs obtained after cardiac death[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2015,48(4):542-547.

[18] Kawamura T, Huang C, Tochigi N, et al. Inhaled Hydrogen Gas Therapy for Prevention of Lung Transplant-Induced Ischemia/Reperfusion Injury in Rats[J]. Transplantation, 2010,90(12):1344-1351.

[19] Noda K, Shigemura N, Tanaka Y, et al. Hydrogen preconditioning during ex vivo lung perfusion improves the quality of lung grafts in rats[J]. Transplantation, 2014,98(5):499-506.

[20] Liu R, Fang X, Meng C, et al. Lung inflation with hydrogen during the cold ischemia phase decreases lung graft injury in rats[J]. Experimental Biology and Medicine, 2015,240(9):1214-1222.

[21] Meng C, Ma L, Niu L, et al. Protection of donor lung inflation in the setting of cold ischemia against ischemia-reperfusion injury with carbon monoxide, hydrogen, or both in rats[J]. Life Sci, 2016,151:199-206.

[22] Liu Q, Li BS, Song YJ, et al. Hydrogen-rich saline protects against mitochondrial dysfunction and apoptosis in mice with obstructive jaundice[J]. Mol Med Rep, 2016,13(4):3588-3596.

[23] Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nat Med, 2007,13(6):688-694.

[24] Zhou H, Fu Z, Wei Y, et al. Hydrogen inhalation decreases lung graft injury in brain-dead donor rats[J]. J Heart Lung Transpl, 2013,32(2):251-258.

[25] Liang C, Liu X, Liu L, et al. Effect of hydrogen inhalation on p38 MAPK activation in rats with lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J]. J South Med Univ, 2012,32(8):1211-1213.

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.045

150001 黑龙江 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第四医院疼痛科

周华成,E-mail：zhouhuacheng@163.com

2016-09-28]