吴连连，袁红花，朱孝荣

（徐州医科大学 1.实验动物中心，2.神经生物研究中心，江苏 徐州 221004）

外源性胰岛素样生长因子-1对老年小鼠认知功能的影响*

吴连连1，袁红花2，朱孝荣1

（徐州医科大学 1.实验动物中心，2.神经生物研究中心，江苏 徐州 221004）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.005

目的探讨胰岛素样生长因子-1（IG F-1）对老年小鼠认知功能的影响机制。方法给予老年C 57/BL6小鼠侧脑室注射IG F-1，W es t ern bl ot检测胰岛素样生长因子-1受体（IG F-1R）蛋白的表达，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）荧光染色标记海马齿状回增殖的细胞，尼氏染色标记海马齿状回神经元，用M orri s水迷宫实验和跳台实验评定老年小鼠学习记忆能力。结果W es t ern bl ot检测显示，IG F-1组老年小鼠海马中IG F-1R表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。BrdU染色结果显示，IG F-1组海马BrdU阳性细胞数与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。尼氏染色结果显示，IG F-1组神经元细胞数与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。水迷宫实验结果显示，经过训练后，IG F-1组老年小鼠的逃避潜伏期短于对照组，穿过平台的次数与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。跳台实验结果显示，与对照组比较，IG F-1组老年小鼠的基础错误次数减少，而潜伏期延长（P＜0.05）。结论老年小鼠注射IG F-1后，其认知功能有一定改善，IG F-1可以提高老年小鼠认知功能。

胰岛素样生长因子-1；老年鼠；5-溴脱氧尿嘧啶核苷；水迷宫；认知功能

衰老是动物体内普遍存在的一个自然的生物学过程。随着年龄的增长，大脑功能也呈现衰退的现象。老年人常表现出学习记忆、认知能力的下降，这与脑老化、神经系统退变有关。海马是大脑中与学习记忆功能关系最密切的一个脑区结构[1]，脑老化及神经系统退变都与海马结构的变化有着密切的关系。

胰岛素样生长因子-1（i nsul i n-l i ke growt h f act ors-1，IGF-1）是一种细胞分裂素，在神经细胞增殖、分化、细胞成活中起重要作用[2-3]。随着年龄的增长及神经系统病变引起的认知缺陷可能与IGF-1缺乏有关[4]。本实验拟通过给予老年小鼠海马注射IGF-1，研究老年鼠海马神经发生的变化及其学习记忆能力的改变，以探讨外源性IGF-1对老年小鼠认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 24个月龄C57/BL6小鼠40只，雌雄各半，体重30～35 g，由徐州医科大学实验动物中心提供。随机分组为对照组（12只）、生理盐水组（14只）和IGF-1组（14只）。

1.1.2 试剂与仪器 重组人IGF-1（美国Chem i con公司），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-brom o-2-deoxyuridi ne，BrdU）（美国Si gm a公司），小鼠抗BrdU单克隆抗体（德国Cal bi ochem公司），小鼠抗胰岛素样生长因子-1受体（i nsul i n-l i ke growt h f act or 1 recept or，IGF-1R）单克隆抗体（美国Sant a Cruze公司），山羊抗小鼠免疫球蛋白 G/异硫氰酸荧光素（美国Bi oworl d公司），尼氏染色液（上海碧云天生物技术有限公司），M orri s水迷宫系统（美国Act i m et ri cs公司），小鼠跳台仪（D．rT-2）（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司），脑立体定位仪（美国Davi d Kopf Inst rum ent s公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 立体定位注射 小鼠经麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头顶部去毛，消毒皮肤，头顶部正中切口，暴露前囟，按小鼠脑立位图谱，坐标为（AP：0.02 m m，M L：8.50 m m，DV：22.50 m m），注射2μl IGF-1。留针5 m i n，慢慢退出注射器，退针2 m i n。对照组注射等量的生理盐水。

1.2.2 BrdU给药 先配制好10 m g/m l BrdU溶液，按预设的时间点给各组小鼠腹腔注射BrdU。给药剂量为每次50 m g/kg，腹腔注射6次，1次/12 h，连续3 d，最后1次注射24 h后灌注固定取脑。

1.2.3 W es t ern bl ot检测 海马组织加入适量的蛋白裂解液，匀浆器匀浆，静置15 m i n，4℃、8 000 r/m i n离心20 m i n，吸取上清。蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，加入相应量的4×十二烷基硫酸钠上样缓冲液，沸水煮5m i n处理蛋白。等量蛋白样品经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（pol yacryl am i de gel el ect rophoresi s，SDS-PAGE）分离后，用半干转法电转移至硝酸纤维素膜上。经5%牛血清白蛋白封闭后加入抗体，IGF-1R抗体（1∶600），4℃孵育过夜。洗涤后加入相应的二抗[IRD yeTM680 cm标记的山羊抗小鼠抗体（1∶1 000）]，室温避光孵育1 h，洗膜。Odyssey激光成像系统扫描，结果以图像处理仪分析处理。

1.2.4 BrdU免疫荧光染色 小鼠经4%多聚甲醛灌注固定，取脑，固定过夜。经30%蔗糖脱水沉糖，行冷冻切片，切片厚10 μm，先以2 m ol盐酸溶液处理使DNA变性，37℃ 30 m i n，以pH=8.5的0.1 m ol硼酸室温中和10 m i n，10%山羊血清封闭40 m i n，滴加一抗，BrdU抗体（1∶500），4℃孵育过夜。滴加荧光二抗（1∶100）孵育1.5 h，封片并于荧光显微镜下观察拍照。

1.2.5 尼氏染色 冻切片10 μm充分晾干，70%酒精脱脂＞4 h，入蒸馏水洗数分钟；0.05%焦油紫醋酸水溶液染色数分钟（镜下观察），100%酒精1 m i n，二甲苯透明，封片。

1.2.6 M orri s水迷宫实验 实验室温度保持在24～26℃，水面高过安全平台1cm，水温保持在20～22℃。将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在90 s内找到安全平台的时间（潜伏期）。如果大鼠在90 s内未能找到平台，则由实验人员用手牵引至平台上，让大鼠停留20 s，再放回笼中，潜伏期记作90 s。实验1～7 d，3次/d，其中第1～4天为训练期，第5～7天为定位航行测试，第8天，为空间探测能力评估。第8天，移去平台，让小鼠自由游泳120 s，并记录下120 s内小鼠穿过平台位置的次数，作为空间探测能力评估。

1.2.7 跳台实验 M orri s水迷宫实验结束后，小鼠休息5 d，进行跳台实验，测试各组小鼠学习和记忆功能。实验时，保持实验室内安静，维持室温在24～26℃。将参加实验的各组小鼠先放入反应箱内自由活动5 m i n，熟悉环境。然后接通铜栅电源（0.25 m A，交流电流），小鼠受到电击后其正常反应是寻找安全跳台以躲避电击。记录各组小鼠跳下安全跳台的时间（潜伏期）和5 m i n内受到的电击次数（错误次数），作为记忆测试成绩。实验时，若小鼠停留在安全跳台的时间＞5 m i n，其潜伏期以5 m i n计算。

1.3 统计学方法

利用图像软件Phot oshop 5.0对图像进行统计学分析，资料用SPSS 16.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析（One-W ay，ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马内IGF-1R蛋白的表达

提取IGF-1组、生理盐水组及对照组海马蛋白，做W est ern bl ot检测，结果显示，IGF-1组海马内IGF-1R蛋白相对表达量（0.44±0.04）高于生理盐水组（0.31±0.04）及对照组（0.29±0.05），差异有统计学意义（F=0.372，P=0.038）。见图1。

图1 各组小鼠海马IGF-1R蛋白的表达

2.2 海马内BrdU阳性细胞数的变化

以BrdU标记海马内新增殖的细胞，免疫荧光染色结果显示，IGF-1组BrdU阳性细胞数（14.00±0.57）高于生理盐水组（4.00±1.00）及对照组（4.00±0.57），差异有统计学意义（F=0.258，P=0.006）。见图2。

2.3 海马内尼氏染色结果

以尼氏染色法观察海马神经元细胞的分布，结果显示，IGF-1组神经元细胞数（329.00±4.91）高于生理盐水组（254.00±6.11）及对照组（257.00±3.28），差异有统计学意义（F=2.362，P=0.008）。见图3。

2.4 Morris水迷宫实验结果

将各组小鼠进行行为学实验测试，在水迷宫实验中，与生理盐水组及对照组比较，IGF-1组小鼠搜索平台潜伏期缩短，差异有统计学意义（F=5.189，P= 0.023）；穿过平台的次数明显增多，差异有统计学意义（F=2.486，P=0.017）。见图4。

2.5 跳台实验结果

跳台实验结果显示，与生理盐水组及对照组比较，IGF-1组小鼠基础错误次数减少（F=6.726，P=0.020），潜伏期延长（F=21.328，P=0.031）。见图5。

图2 各组小鼠海马齿状回BrdU免疫荧光染色结果

图3 各组小鼠海马齿状回尼氏染色结果

图4 水迷宫实验结果

图5 跳台实验结果 （n=12±s）

3 讨论

老化过程常常伴随着记忆的减退，甚至病理状态的改变[4-6]。在老年大脑中，发现有很多与年龄相关的变化，如突触传递的损伤，神经传递素的合成和释放，长时程增强作用，葡萄糖的利用，受体浓度等[7-9]。一直以来，海马被认为是大脑中参与学习记忆等活动最主要的一个结构，在老年动物海马功能的一系列改变中，最显著的变化是齿状回活性的减弱[10]。

IGF-1是一种在大脑功能中有多种作用的多肽，广泛表达于大脑多个部位，且在海马齿状回神经发生和突触形成具有重要作用。随着年龄的增长，老年动物学习记忆能力呈现衰退现象，这可能与脑中IGF-1的浓度下降有关。LEE等[11]研究表明，IGF-1和IGF-1R在老年小鼠海马中的表达下降。然而，也有研究表明，IGF-1水平在老年鼠和年轻鼠中并未有差异[12]，尽管这个问题至今还存在争议，但是IGF-1在动物衰老过程及海马认知能力上的作用不容忽视。已有文献证实，IGF-1通过与其受体结合，提升细胞内酪氨酸激酶活性，从而激活丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶信号通路，调控细胞周期、基因表达、细胞增殖等[13]。本课题组前期利用过表达IGF-1的转基因小鼠，研究表明，IGF-1在体内可以促进成年小鼠神经干细胞增殖和分化，从而促进神经发生[14]。IGF-1还影响神经元成熟过程包括神经传递素的产生，以及电生理活性等多个方面[15]。本实验结果显示，老年鼠侧脑室注射IGF-1后，海马内受体蛋白IGF-1R的表达会提高，并且新增殖细胞数和神经元数也明显增多，这提示外源性IGF-1在老年鼠体内与受体结合，并促进海马神经细胞增殖和神经元产生。

目前，关于海马神经发生与认知能力的相关性还有一些争议，有报道表明，认知缺陷与海马全部或部分神经发生功能的丧失密切相关，COUILLARD等[16]认为，神经发生不是学习能力的必要因素，但可以促进其功能。ANDERSON等[17]认为，老化过程与神经发生及IGF-1水平的降低有关，注射IGF-1的老年大鼠其脑内神经发生会增加并且认知障碍得到一些恢复。笔者的行为学试验结果表明，给予外源性IGF-1注射后，可以提高老年小鼠的学习记忆有关的认知能力，但IGF-1是否直接通过促进老年鼠海马的神经发生等活动来提高认知功能，还不能十分确定，或许是有一定关系，但仍需进一步研究，这也是目前为止还存在争议的一个问题。但本研究结果表明，IGF-1可以促进老年小鼠的学习、记忆等认知能力的提高。

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（童颖丹 编辑）

Effect of exogenous insulin-like growth factors 1 on cognitive function in aged mice*

Lian-lian Wu1,Hong-hua Yuan2,Xiao-rong Zhu1
(1.Laboratory Animal Center;2.Research Center for Neurobiology, Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221004,China)

ObjectiveTo investigate the the effects of insulin-like growth factor 1 (IGF-1)on cognitive function in aged mice after microinjection of IGF-1.MethodsIGF-1 was injected into the lateral ventricles of aged C57/BL6 mice.The expression of IGF-1R was assayed by Western Blot.The proliferative cells of the hippocampal dentate gyrus were marked by 5-bromodeoxyuridine (BrdU)immunofluorescence.The neurons of the hippocampal dentate gyrus were determined by Nissl staining.Morris water maze and step-down test were performed to evaluate the cognitive function of the aged mice.ResultsWestern blot results showed that the protein level of IGF-1R increased in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).BrdU immunofluorescent results revealed BrdU-positive cells were obviously increased in the IGF-1 treated group compared to the control group(P＜0.05).Nissl staining revealed the increased number of neurons in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).Morris water maze test showed that escape latency of the IGF-1 treated group was significantly shorter than that of the control group after training,and the number of times through the platform was significantly larger than that of the control group (P＜0.05).Step-down test showed that the number of times of basal errors was dramatically smaller,and the latency was significantlylonger in the IGF-1 treated group compared with the control group(P＜0.05).ConclusionsAfter injection of IGF-1,the neurocognitive functions of aged mice were improved,so we may indicate that IGF-1 may improve the cognitive function in aged mice.

insulin-like growth factors 1;aged mice;5-bromo-2-deoxyuridine;Morris water maze;cognitive function

1005-8982（2017）03-0022-05

R 322.81

A

2016-05-31

江苏省自然科学基金（No：BK2010180、BK20151151）

朱孝荣，E-m ai l：zxr1967@126.com；Tel：0516-83262060