李艳晓，高颖，王火，陈虹

（1.天津中医药大学，天津 300110；2.中国人民武装警察部队后勤学院 生药与药剂教研室，天津 300309）

基础研究·论著

莲子心提取物对博来霉素致小鼠肺纤维化的干预作用研究*

李艳晓1，高颖2，王火2，陈虹2

（1.天津中医药大学，天津 300110；2.中国人民武装警察部队后勤学院 生药与药剂教研室，天津 300309）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.001

目的比较莲子心提取物（LE）水洗脱（LEW W）和醇洗脱（LEAW）对博来霉素诱导小鼠肺纤维化（PF）的作用。方法经气管一次性滴注博来霉素复制PF小鼠模型，给予2种LE灌胃21 d后，解剖肺脏，苏木精-伊红染色法观察小鼠肺组织炎症程度并进行炎症评分，M as s on染色观察PF程度，计算肺系数，检测血清还原型谷胱甘肽（G SH）、一氧化氮N O，逆转录聚合酶链反应检测转化生长因子β1（TG F-β1）、α平滑肌肌动蛋白（α-SM A）、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲm R N A表达水平，酶联免疫吸附法检测肺组织匀浆TG F-β1、α-SM A及羟脯氨酸（H Y P）的蛋白表达水平。结果与模型组比较，LEW W 和LEAW组G SH在血清中含量均升高，N O含量降低；肺组织匀浆中TG F-β1、α-SM A、H Y P含量降低（P＜0.05）。结论LE对博来霉素所致PF小鼠有一定防治作用，其机制可能与LE抗氧化、抑制胶原蛋白形成及下调TG F-β1有关。

莲心提取物；肺纤维化；胶原纤维；转化生长因子β1

肺纤维化（pul m onary f i brosi s，PF）是一种以弥漫性肺泡炎和成纤维细胞病理性增生所致细胞外基质沉积为特征的慢性进行性肺疾病，是多种肺疾病发展到晚期常见的病理过程[1]。本病致病因素复杂，病理机制不明确。目前学术界认为氧化-抗氧化机制失衡是纤维化主要发病机制之一，转化生长因子β1（t ransf orm i ng growt h f act or，TGF-β1）及其下游α平滑肌肌动蛋白（al pha-sm oot h m uscl e act i n，α-SM A）也在PF发病中起重要作用。

莲子心为常用中草药之一，为睡莲科植物莲种子中的青嫩胚芽,味苦、性寒。在其水提物与醇提物中主要有效成分为莲心碱、甲基莲心碱、异莲心碱及莲心碱高氯酸盐等[2]。据报道，异莲心碱对半乳糖致小鼠肺纤维化的氧化损伤有一定保护作用[3]，但对莲子心提取物水洗脱（l ot us ext ractwashed wi t h wat er，LEW W）、莲子心提取物醇洗脱（l ot us ext ract al cohol wash，LEAW）的抗纤维化作用还未有文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 72只健康昆明雄性小鼠，无特定病原体级，体重18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2013-0001。实验动物在洁净级动物房适应性喂养1周，饲料由中国医科学院动物研究所提供，饮用水为自来水，实验期间小鼠自由饮水和进食。

1.1.2 药品及试剂 莲心提取物（l ot us ext ract，LE）（中国人民武装警察部队后勤学院植物化学实验室提供）,注射用盐酸博莱霉素（浙江海正药业股份有限公司，H 20055883）,苏木精-伊红染色（hem at oxyl i n-eosi n，H E）、M asson染色、一氧化氮合酶及还原性谷胱甘肽试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Tri zol Reagent由美国Invet rogen公司生产,逆转录试剂盒购自北京天根技术有限公司,聚合酶链反应（pol ym erase chai n react i on，PCR）引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，TGF-β1、α-SM A、羟脯氨酸（hydroxyprol i ne aci d，H YP）试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器 TS100型倒置显微镜及其配套图像采集系统（日本Ni kon公司），Advent urer万分之一电子天平和TDL-5M低温离心机（上海卢湘仪器厂），5417R高速低温离心机和移液器（德国Eppendorf公司），UV-260型紫外可见分光光度计（日本Shi m adzu公司），BCD-77KD3常温冰箱（广东TCL公司），置入-80℃冰箱低温保存（安徽美菱冰箱），SW-CJ-2FD型无菌操作台（苏州仪器净化厂），PTC-200型PCR（美国M J Research公司），电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型复制、分组及给药 将72只小鼠随机分为正常组、模型组、维生素C组、地塞米松组、LEW W组和LEAW组，每组12只。除正常组外，其他5组小鼠均经气管滴注博莱霉素（2 m g/kg），正常组注入等量生理盐水。模型复制后第2天，LEW W组和LEAW组分别灌服LEW W、LEAW[100 m g/（kg·d）]，维生素C组经腹腔注射维生素C 100 m g/（kg·d），正常组和模型组给予等体积生理盐水，1次/d，共给药21 d，地塞米松组经腹腔注射地塞米松2 m g/（kg·d），1次/d，共给药3 d。

1.2.2 实验动物的处理和标本收集 小鼠在造模21 d称重后眼球摘除取血并脱颈处死，分离肺组织，称肺重。血液离心后取血清置于-20℃冰箱冷冻保存，1周内用于检测一氧化氮NO、谷胱甘肽（Gl ut at hi one，GSH）等氧化指标。左肺用10%福尔马林固定，24 h后进行。石蜡包埋并组织切片行H E染色及M asson染色，右肺分置冻存管，迅速置入液氮罐后转入-80℃冰箱保存以用于TGF-β1、H YP等浓度测定和PCR测定。

1.2.3 检测方法 肺系数=肺重（g）/体重（g）× 100%。血清中NO、GSH含量严格按照试剂盒说明书操作。酶联免疫吸法检测各组血清中超氧化物歧化酶（superoxi de di sm ut ase，SOD）、丙二醛、肺组织匀浆中H YP、TGF-β1浓度，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 组织病理学观察 参照SZAPIEL等[4]的方法评价肺泡炎及肺纤维化程度，H E染色评定肺泡炎分级：评0分，无肺泡炎；评1分，轻度肺泡炎，评2分，中度肺泡炎，评3分，重度肺泡炎。M asson染色评定肺纤维化分级：评1分，无纤维化；评2分，轻度纤维化，肺泡的结构发生紊乱；评3分，中度纤维化，病变范围约占全肺的20%～50%；评4分，重度纤维化，病变范围＞50%。

1.2.5 莲子心提取物对小鼠相关基因的表达 Tri zol法提取总m RNA，逆转录为cDNA后行PCR反应。凝胶自动成像系统观察电泳结果，Quant i t y One软件分析目的片段与内参的光密度值，将两者比值作为目的基因的相对表达量，每个样本重复3次。目的基因引物序列、片段长度及退火温度见表1。

表1 逆转录PCR的引物序列、产物大小及退火温度

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常组：小鼠身体健壮，活泼好动，皮毛光滑，进食量多，体重增加明显，唇及爪色泽淡红。模型组：模型复制后，小鼠很快出现精神不振，皮毛干枯无光泽，少动，进食少，体重减轻，唇及爪轻度紫绀，约1周后食欲与体重有改善。维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组：精神状态、进食、活动、体重均较模型组较好，唇及爪轻度紫绀未见明显。

2.2 LE对博来霉素致小鼠肺纤维化的影响

2.2.1 病理改变 除正常组外，其余各组小鼠肺组织结构完整性均受到不同程度破坏，肺泡壁加厚，出现不同程度充血及炎症细胞浸润，且尤以模型组小鼠上述指标改变最为显著（见图1）。与正常组比较，模型组M asson染色见肺泡间隔明显增宽，胶原纤维增多，肺泡结构改变，成纤维细胞大量聚集，大量胶原纤维成束状或者片状沉积，肺泡壁变厚，肺泡结构紊乱。维生素C组、地塞米松组与LEW W、LEAW组表现出基本一致的变化规律，但肺泡炎和纤维化的程度减轻（见图2）。

2.2.2 肺泡炎症、纤维化等级评分 与正常组比较，模型组小鼠肺组织炎症及纤维化程度均增高，各组小鼠肺泡炎症程度评分及纤维化程度评分比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=107.113和 87.230，P=0.013和0.025）。维生素C组、地塞米松组与模型组肺泡炎症程度及纤维化程度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=7.126和3.523，P=0.000）。维生素C组、地塞米松组、LEW W组和LEAW组与模型组肺泡炎症程度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=4.762、3.561、3.142和3.827，P=0.000）。LEW W组与维生素C组和LEAW组肺泡炎症程度比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（t=0.031和0.061，P=0.057和0.112）。LEW W组与地塞米松组肺泡炎症程度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=0.412，P=0.031）；维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组与模型组纤维化程度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=2.768、6.235、4.162和3.251，P=0.000）。LEW W组与维生素C组纤维化程度比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=5.142，P=0.022），LEW W组与地塞米松组、LEAW组纤维化程度比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（t=0.361和0.823，P=0.712和0.634）。上述结果表明，模型组肺泡炎症程度及纤维化程度均高于维生素C组、地塞米松组、LEAW组及LEW W组，其中LEAW组与LEW W组抗炎和抗纤维化比较，差异无统计学意义，但优于维生素C组。见表2。

2.3 LE对肺纤维化小鼠体重、肺湿重及肺系数的影响

与正常组比较，模型组小鼠体重减轻，肺湿重和肺系数增大，经单因素方差分析，差异有统计学意义。正常组小鼠体重、肺湿重及肺系数与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=6.126、8.231和3.242，P=0.000）。LEAW组小鼠体重、肺湿重及肺系数与模型组比较，差异有统计学意义（t= 3.728、7.912和 14.232，P=0.012、0.032和 0.041）。LEW W组小鼠体重、肺湿重及肺系数与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=1.612、2.078和4.292，P=0.014、0.033和0.021）。维生素C组、地塞米松组与LEAW组肺系数比较，差异有统计学意义（t=2.913和7.123；P=0.012和0.031）。LEW W组与LEAW组小鼠肺湿重、肺系数比较，差异有统计学意义（t=1.231和2.812，P=0.013和0.314）。LEW W组与LEAW组小鼠体重比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（t=3.121，P=0.512）。上述结果表明，LEAW、LEW W可使小鼠体重增长，降低肺湿重和肺系数，且效果与地塞米松相当，但两者对体重的改变差异无统计学意义。见表3。

图1 各组小鼠肺组织病理改变 （H E×200）

图2 各组小鼠肺组织病理改变 （M asson×200）

2.4 LE对博来霉素致肺纤维化小鼠血清GSH、NO的影响

各组小鼠血清中GSH、NO含量比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义。维生素C组、地塞米松组与模型组GSH、NO含量比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=6.182和12.124，P=0.000）；维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组与模型组GSH比较，差异有统计学意义（t=4.912、3.626、3.935和3.867，P=0.000）；LEW W组与维生素C组、地塞米松组及LEAW组GSH比较，差异有统计学意义（t= 5.231、6.243和3.563，P=0.021、0.032和0.041）。维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组与模型组NO含量比较，差异有统计学意义（t=2.192、5.122和4.143，P=0.031、0.021和0.022）；LEW W组与维生素C组、地塞米松组NO含量比较，差异有统计学意义（t=9.322和4.243，P=0.210和0.042）；LEW W组与LEAW组NO含量比较，差异无统计学意义（t= 2.535，P=0.712）。上述结果表明，模型组GSH含量低于维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组，但其NO含量高于维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组。LEW W组和LEAW组对抑制GSH含量降低的效果弱于维生素C组、地塞米松组。见表4。

表2 各组小鼠炎症及纤维化程度评分 （n=7，分，±s）

表2 各组小鼠炎症及纤维化程度评分 （n=7，分，±s）

组别 纤维化程度评分正常组 0.45±0.05 1.62±0.07模型组 2.47±0.18 3.24±0.35维生素C组 1.72±0.21 2.71±0.22地塞米松组 1.30±0.17 2.36±0.14 LEW W组 1.55±0.16 2.47±0.21 LEAW组 1.32±0.08 2.55±0.19 F值 107.113 87.230 P值 0.013 0.025肺泡炎症评分

表3 各组小鼠体重、肺湿重及肺系数比较 （n=7±s）

表3 各组小鼠体重、肺湿重及肺系数比较 （n=7±s）

组别肺系数正常组 100 28.58±1.36 0.1989±0.012 0.5339±0.0376模型组 100 21.12±0.92 0.2514±0.019 0.8165±0.0565维生素C组 100 24.25±0.77 0.2158±0.017 0.7135±0.0469地塞米松组 2 25.45±1.26 0.2280±0.022 0.6434±0.0826 LEW W组 100 24.65±1.21 0.2182±0.015 0.6683±0.0188 LEAW组 100 25.13±0.88 0.2193±0.020 0.6631±0.1682 F值 15.162 10.318 54.126 P值 0.025 0.039 0.027剂量/（m g/kg）体重/ g肺湿重/ g

表4 各组小鼠血清中GSH、NO浓度比较（n=7，μm ol/L±s）

表4 各组小鼠血清中GSH、NO浓度比较（n=7，μm ol/L±s）

组别NO正常组 33.56±7.74 2.71±0.72模型组 28.99±4.81 8.36±0.25维生素C组 39.95±8.02 6.03±0.68地塞米松组 44.06±10.64 4.22±0.33 LEW W组 43.15±11.18 4.07±0.51 LEAW组 34.47±6.96 3.16±0.27 F值 132.104 42.172 P值 0.041 0.016GSH

2.5 LE对肺纤维化小鼠TGF-β1、α-SMA、CollengenⅠ及CollengenⅢmRNA表达的影响

各组小鼠 TGF-β1、α-SM A、Col l engenⅠ及Col l engenⅢ m RNA表达，经单因素方差分析，差异有统计学意义。与对照组比较，模型组TGF-β1、α-SM A、Col l engenⅠ及Col l engenⅢm RNA表达量比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=3.028、3.927、8.927和5.928，P=0.000），模型组升高；与模型组比较，维生素C组、地塞米松组、LEW W组及LEAW组可下调TGF-β1、α-SM A及Col l engenⅢ m RNA表达量，LEAW可同时下调Col l engenⅠm RNA的表达水平；LEAW 组与 LEW W 组 TGF-β1、α-SM A、Col l engenⅠ m RNA水平比较，差异有统计学意义（t= 3.291、4.928和 7.283，P=0.023、0.029和 0.041），LEAW组下调TGF-β1、α-SM A、Col l engenⅠm RNA表达的能力优于LEW W组。见表5和图3。

表5 各组小鼠肺组织TGF-β1、CollengenⅠ及CollengenⅢ mRNA表达水平比较 （n=7±s）

表5 各组小鼠肺组织TGF-β1、CollengenⅠ及CollengenⅢ mRNA表达水平比较 （n=7±s）

组别Col l engenⅢm RNA正常组 0.74±0.06 0.58±0.03 0.60±0.012 1.01±0.09模型组 1.15±0.12 1.24±0.11 1.29±0.11 1.12±0.15维生素C组 0.77±0.07 0.86±0.06 1.23±0.17 1.19±0.14地塞米松组 1.20±0.16 0.82±0.09 0.71±0.1 1.03±0.08 LEW W组 0.79±0.11 1.05±0.12 1.38±0.15 0.78±0.07 LEAW组 0.64±0.08 0.77±0.58 0.76±0.02 0.79±0.16 F值 23.142 45.834 76.164 42.186 P值 0.019 0.036 0.012 0.002TGF-β1m RNAα-SM A m RNACol l engenⅠm RNA

图3 各组小鼠肺组织TGF-β1、α-SMA、CollengenⅠ及CollengenⅢ mRNA表达情况

2.6 LE对博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA及HYP含量的影响

各组小鼠肺组织中TGF-β1、α-SM A及H YP含量表达，经单因素方差分析，差异有统计学意义。与模型组比较，对照组中TGF-β1、α-SM A及H YP含量比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t= 6.203，9.382和3.827，P=0.000），对照组含量升高；与模型组相比，给药组小鼠肺组织中TGF-β1、α-SM A及H YP含量均有不同程度的降低，LEAW组与维生素C组、地塞米松组及LEAW组TGF-β1和H YP含量比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=7.292和3.927，P=0.012和=0.024），LEAW组最低。见表6。

表6 各组小鼠肺组织 TGF-β1、α-SMA及HYP浓度比较 （n=7±s）

表6 各组小鼠肺组织 TGF-β1、α-SMA及HYP浓度比较 （n=7±s）

组别H YP/（μg/L）正常组 16.11±2.14 12.91±0.24 6.46±0.71模型组 98.76±13.78 28.24±0.42 16.45±2.41维生素C组 67.92±9.24 17.44±0.13 13.62±1.14地塞米松组 45.43±5.10 16.58±0.23 13.57±1.52 LEW W组 48.72±4.82 17.12±0.21 12.84±1.23 LEAW组 36.00±4.38 16.76±0.24 12.13±1.41 F值 75.142 56.823 46.712 P值 0.004 0.014 0.007TGF-β1/（ng/L）α-SMA/（ng/L）

3 讨论

PF是一种进行性、不可逆的慢性肺间质纤维化疾病，且5年存活率低[5]。PF疾病早期可出现氧化应激，引发炎症反应。正常机体抗氧化系统中主要包括酶类抗氧化系统如SOD、髓过氧化物酶、GSH等和费酶类抗氧化系统如维生素C、E等[6]。GSH是一种低分子自由基清除剂，可防止血红蛋白及其他辅因子受氧化损伤。在复杂的纤维化病理过程中NO不仅可与氧自由基产生氧化物，而且可作为细胞信号分子介导肺泡巨噬细胞及肺泡上皮细胞等细胞的增殖或凋亡来参与肺间质纤维化的形成。莲子心作为一种传统中药材，具有很明显的抗炎、抗氧化等多种药学活性。在本实验中给予LE干预性治疗后，与模型组相比其氧化生成产物GSH升高，NO含量降低，表明LE具有对博来霉素诱导肺纤维化抗氧化应激的作用。肺纤维化后期主要表现为肺间质增宽、细胞外基质沉积及胶原纤维（Col l engenⅠ及Col l engenⅢ）大量生成[7]，形成广泛纤维化。H YP作为胶原纤维蛋白中主要的组成成分，可准确地间接反映胶原纤维蛋白的含量[8]。近年来有研究证实，TGF-β1为关键的致肺纤维化的细胞因子，可以促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，上调其下游的α-SM A表达[9]，并促进细胞外基质的生成与沉积，进一步促进肺纤维化的发展[10]。细胞外基质主要由成纤维细胞病灶转型的肌成纤维细胞组成，其主要表达产物为α-SM A[11]。本实验研究发现，LE可降低对博来霉素致小鼠肺纤维化模型肺组织TGF-β1、α-SM A、Col l engenⅠ及Col l engenⅢ m RNA表达；酶联免疫吸附法检测显示，LE给药组H YP表达降低。另外从M asson染色的病理切片中见其可有效抑制胶原纤维形成，降低肺纤维化程度。实验证明，LE能抗博来霉素之小鼠肺纤维化，且LEAW组效果明显优于维生素C组。

综上所述，莲心提取物可通过抗氧化、抑制胶原纤维形成及下调TGF-β1，进而抑制成纤维细胞的活化、增殖，下调α-SM A的表达，减少细胞外基质的大量沉积，发挥其抗纤维化作用。

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（童颖丹 编辑）

Intervention ofPlumula Nelumbinisextracts on Bleomycininduced pulmonary fibrosis of mice*

Yan-xiao Li1,Ying Gao2,Huo Wang2,Hong Chen2
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300110,China;2.Department of Pharmacy,Logistics College of Chinese People's Armed Police Force, Tianjin 300309,China)

ObjectiveTo investigate the effect ofPlumula Nelumbinisextracts eluted with water(LEWW) or alcohol (LEAW)on Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.MethodsThe mouse model of pulmonary fibrosis was prepared by disposable intratracheal instillation of Bleomycin.The two kinds ofPlumula Nelumbinisextracts were administrated orally for 21 days.After that,the lung tissues were obtained for HE staining and Masson staining;and inflammation score and the degree of pulmonary fibrosis,lung coefficient calculation,serum glutathione(GSH)and nitric oxide(NO)were evaluated.RT-PCR was used for detection of transforming growth factor-β1(TGF-β1),smooth muscle actin (α-SMA),collagen-Ⅰ,collagen-Ⅲ mRNA expression levels.TGF-β1,α-SMA and hydroxyproline (HYP)protein expression levels in the lung tissues were measured using ELISA.ResultsCompared with the model group,the serum content of GSH increased,NO decreased;meanwhile the content of TGF-β1,α-SMA and HYP in the lung homogenate was lowered in the LEWW and LEAW groups (P＜0.05).ConclusionsPlumula Nelumbinisextracts have anti-fibrotic effect to Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.The mechanism may be related to the anti-oxidant activity of Plumula Nelumbinisextracts,inhibition of collagen formation and down-regulation of TGF-β1.

Plumula Nelumbinisextract;pulmonary fibrosis;collagen fiber;transforming growth factor-β1

1005-8982（2017）03-0001-06

R 285.5

A

2016-05-11

国家自然科学基金（No：81503233）；武警后勤学院院级课题（No：W H J201510）

高颖，E-m ai l：gyi ng77@163.com；Tel：15922098199