黄钰竹，王薇，赵海建，王治国(.北京医院国家老年医学中心，卫生部临床检验中心/北京市临床检验工程技术研究中心，北京 00730；2.北京协和医学院研究生院，北京 00730)

·专题笔谈·

美国CLSI M52和CNAS指南关于商品化微生物鉴定系统及药敏试验系统验证方法的比较*

黄钰竹1,2，王薇1，赵海建1，王治国1,2
(1.北京医院国家老年医学中心，卫生部临床检验中心/北京市临床检验工程技术研究中心，北京 100730；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730)

美国临床和实验室标准化协会(CLSI)在2015年发布了文件M52-商品化微生物鉴定及药敏试验系统的验证研究，旨在为执行验证研究的实验室提供指导性建议。在实验室将商品化微生物鉴定系统和药敏试验系统应用到常规检测之前，应对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。该文将CLSI文件M52和中国合格评定国家认可委员会(CNAS)指南中关于商品化微生物鉴定系统及药敏试验系统的验证方法进行比较，结合国内临床微生物实验室的部分情况，分析对比两者之间的差异，以供国内临床微生物实验室制定符合自身情况的验证方案。

微生物鉴定系统；药敏试验系统；验证方法；商品化

当实验室引入商品化微生物鉴定系统(microbial identification system，MIS)或药敏试验系统(antimicrobial susceptibility testing system，ASTS)时，或当前使用系统发生重要改变时，美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M52文件[1]要求进行验证研究。实验室应从制造商或方法开发者处获得相关信息，以确定检验程序的性能特征[2]。验证研究的目的在于验证当前系统是否满足厂商规范，实验室人员检验得到正确及可重复结果的能力以及实验室是否满足监管要求。验证过程证实的检验程序的性能指标应与检验结果的预期用途相关[2]。M52 提及的验证性能指标包括正确度、精密度(重复性)、检测结果的报告范围以及厂商参考范围是否适用于实验室患者。该文件同时给出了验证过程的具体流程，包括执行验证前活动、准备验证协议、执行验证检测(MIS和/或ASTS)、判断是否满足可接受标准、解决差异结果、记录结果、实验室主管审查等[1]。临床微生物实验室可参考其流程，结合中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)指南[2-3]，制定针对各个微生物实验室的验证方案。

1 验证要求

实验室在进行验证前，可参考CLSI文件EP23TM[4]评估实验室相关风险，并在执行验证研究时，至少保证30个样品量。CLSI M52要求厂商在验证开始前安装仪器、检查系统能否正常运行，实验室须针对新系统的使用及验证过程的执行培训相关人员，并在验证开始前用厂商推荐的质控菌株获得可接受结果。

细菌鉴定和药敏系统的验证，应按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其他已知菌株对商品化鉴定系统(包括自动、半自动、手工)每种板(条/卡/管)的鉴定/药敏结果符合性进行验证[2]。验证开始前实验室须根据分析类型及用途制定验证方案，确定验证计划和可接受标准。CNAS指南GL41[2]定义定量检测的可接受标准的方法之一是根据医学和临床要求确定总允许误差，定性检测的可接受标准可以用一致率(符合率)表达。CNAS指南CL42[3]提供了微生物鉴定和抗菌药物敏感性试验程序须满足的具体要求，微生物鉴定所选择的涂片、染色技术、培养基应能从样品中分离、识别相应的病原菌，鉴定方法应符合要求；明确伤口样品培养程序，深部伤口感染应至少包括样品采集、需氧菌及厌氧菌的培养及鉴定；厌氧菌培养时间与样品类型、诊断有关，在第一次培养评估之前应有足够的培养时间(至少48 h)。

目前国内临床微生物实验室在采用新批号及新货次的MIS和ASTS试剂时，都会采用相应的配套的质控物质(质控菌株)进行常规质控，并根据各自实验室的工作特点和具体情况对质控频率进行动态调整，以验证其性能是否满足要求，实验室均存有每批号产品质量控制试验合格等文件[5]。关于MIS和ASTS试剂及耗材的验证要求，CNAS指南CL42详细给出了具体的方案，可供实验室参考。

2 验证方案

2.1 样本选择 质控菌株的检测仅仅是MIS和ASTS验证的一部分，实验室应根据检测系统的类型选择合适的菌株类型和数量。就MIS验证过程的样本选择而言，CLSI M52建议根据MIS的预期用途选择检测菌种的类型。对于鉴定范围广泛的实验室须审查实验室所有分离菌种的分布和频率，如此便能测定80%～90%实验室通常分离的菌种，建议每个菌种检测3～5株菌；对于新引入系统或系统发生变化的实验室，每个应用(如新的生化平板)应至少检测30株菌[1]。检测的菌种类型应包括：经MIS鉴定的菌种、肠杆菌科中的常见菌种、不常见的病原体如非发酵菌、革兰阳性菌、其他在特定患者人群中出现的菌种(如酵母菌或苛养菌)及MIS数据库中的菌种。菌株可来自临床，也可从其他途径获得，如商品化菌种保存处和/或能力验证(proficiency testing，PT)调查中保存的菌株。CNAS指南GL41建议按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其他已知菌株，试验应覆盖实验室使用的全部卡片种类和/或方法。参照厂商说明书选择菌株种类，包括临床留样菌株和标准/质控菌株，每种类型应至少1株，总体不少于20 株[2]。大型医院患病群体复杂，微生物种类多，因此该类医院应对更多的菌株进行评估，验证菌株的选择应考虑样本获取难易程度及患者等因素。

就ASTS验证过程的样本选择而言，国内多数医院的临床微生物实验室对药敏系统的验证仅限于使用质控菌株对已知的抗菌药物进行敏感性测试[6]，这往往不足以保证验证后的ASTS性能符合要求。CNAS指南给出的验证方案是使用药敏质控菌株和根据厂家说明书要求的药敏卡验证药敏试验系统性能。要求既保证药敏试验的准确性，又要确保耐药菌株的检出敏感性。CLSI M52要求进行ASTS验证时，每药敏板至少检测30株菌。选择菌株类型时还应考虑板卡类型、每个药敏试剂的活性谱[7]、检测范围、敏感和非敏感表型。建议使用新鲜临床菌株、来自实验室的冻存菌株、质粒携带耐药基因菌株，也可用来自PT调查或其他来源的菌株。检测前，再次培养所有冻存菌株并保证培养时间的时效性(不超过24 h)。

2.2 验证方法 CNAS指南GL41给出关于MIS的验证方法是让实验室根据厂商说明书或实验室检测程序规定对验证菌株进行检测，鉴定水平一般是种。对于特殊类型的微生物(如棒状杆菌、厌氧菌和芽胞杆菌)，可鉴定到属水平。指南中还给出了血清学鉴定试验的验证方案，包括沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌等，菌株类型根据当地卫生行政管理和实验室具体情况选择，每种本地区常见血清型菌株至少1株。关于ASTS的验证，CNAS指南CL42中的方案：连续检测20～30 d，每一组药物/细菌的抑菌圈直径或最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)超出参考范围的频率应不超过1/20或3/30；也可采用替代质控方案，即连续5 d，每天对每一组药物/细菌重复测定3次，每次单独制备接种物，15个数据中超出参考范围(抑菌圈直径或 MIC)的结果应不超过1个，若失控结果为2～3个，则如前述，再进行5 d，每天3次重复试验，30个数据失控结果应不超过3个。以上验证结果通过后可转为每周使用标准菌株进行质控。若检测频率小于每周1次，则应在每个检测日进行质控。用自动或半自动仪器检测MIC时，应按照制造商要求进行质控。

CLSI M52认为精密度(重复性)和正确度是MIS和ASTS验证过程中最重要的性能指标，验证方法就两个指标展开。为检测MIS的精密度，可选用MIS完整质控数据集的一个有代表性的子集，其中应包括MIS的关键指示菌株和临床菌株。最少检测5株菌株(质控或临床菌株)，每株菌检测3次，同时应比较鉴定结果和非个体基质效应。考虑ASTS的精密度时，应考虑药敏试剂±1个稀释度的变化(抗真菌试剂应考虑±2个稀释度的变化)，使用有代表性的质控菌株子集和临床菌株，至少检测5株菌(质控或临床菌株)，每株菌检测3次，可在同一天或多天内进行检测，不要求用当前系统检测菌株。当评估ASTS的精密度时，至少95%的菌株检测结果应在基本一致(essential agreement，EA)内，至少95%的质控菌株结果应在质控范围内。

评估ASTS正确度时，首先选择适当的参考方法。实验室可将新引入的药敏试验系统和当前或已验证的ASTS进行比较。若当前未使用商品化的ASTS，则可用新引入的ASTS检测已知药敏结果的保存菌株；或者将新引入ASTS的药敏结果与参考实验室的检测结果进行比较，其中参考实验室指的是经美国临床检验改进修正计划(Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA)认证的商业性实验室或其他应用已验证过ASTS的诊断实验室。实验室也可将新引入的ASTS与参考方法(如纸片扩散法或肉汤微量稀释法)进行比较加以验证。如果新系统与当前系统等效或更好，则认为该测试是有效的。其次分析ASTS结果时应考虑分类一致(category agreement，CA)(新系统和当前系统对敏感、中介和耐药结果的一致性)及EA(如新系统的一个细菌MIC结果在旧系统MIC结果的一个稀释度内；新系统的一个酵母菌MIC结果在旧系统MIC结果的2个稀释度内)的评估。可接受性能要求CA和EA的一致性均≥90%[1]。

2.3 可接受标准 CNAS指南GL41建议用一致性(符合率)表达定性检测结果的可接受标准，并给出了微生物鉴定的具体符合率供实验室参考，即标准/质控菌株的符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上，血清学鉴定试验要求准确率100%。如若未能满足要求，则该检测系统不能通过验证或者制造商和/或使用者须采取措施，修正后的检测系统应再次进行验证。实验室将新的药敏试验系统应用于临床前，须满足质控要求，通过后在日常检测中转为室内控制要求。实验室应对较大和重大偏差进行分析[2]。

CLSI M52就MIS和ASTS的质量控制和可接受标准给出了详细的方案。一旦证明MIS可提供重复性结果，则无需对整个验证过程进行质量控制，除非厂商说明书要求执行。当MIS新系统显示错误或不显示鉴定结果时，要求在鉴定前进行额外检测。实验室须详细审查MIS新系统的结果差异类型，若新系统的数据库不包括当前系统数据库中的部分菌株，则考虑用替代方法检测这些菌株。实验室无需对每一菌株进行验证，报告菌株鉴定结果时，要求额外检测能使用户对微生物鉴定结果的正确度满意。

在ASTS验证过程中，CLSI M52建议每天对新系统进行质量控制。如CLSI文件M02[8]和M07[9]中所述，微生物实验室想减少ASTS的质控频率，将频率从每日缩减到每周，这些实验室须使用支持该类改变的数据执行个体化质量控制方案(individualized quality control plan，IQCP)。厂商在出售药敏平板前，对美国食品及药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的每台仪器和每一药敏试剂都建立了严格的标准(包括EA和生长失败等)[10-11]。若出现CA和EA≥90%、总耐药菌株的非常主要差异(very major discrepancy，VMD)或非常主要误差(very major error，VME)率<3%[12]、总敏感菌株的主要差异或主要误差率<3%这 3种情况之一时，则考虑ASTS已成功验证。若检测系统未满足任何一项标准，则须进行额外测试。国内大多数微生物实验室都建立了微生物检验的标准化操作程序(standard operation procedure，SOP)，其中包括微生物鉴定和药敏试验质量控制方案和可接受标准[5]，实验室人员按照SOP进行日常质控工作，以保证结果在可接受范围之内。但是我国目前没有统一或公认的临床微生物实验室标准，多数实验室参照CLSI文件，比如在常规状况下，药敏试验系统质量控制的质量和频度按M100[7]执行。

3 小结

CLSI文件M52是以美国临床微生物实验室为研究中心的文件，其中部分内容反映了美国的监管要求，将其与CNAS指南中关于商品化微生物鉴定系统和药敏试验系统验证方法的内容进行对比，两者存在较大差异。CLSI M52提供的验证方法适用于当实验室新引入微生物检测系统，或实验室采用新的鉴定培养基、药敏试剂、数据库、软件或硬件而造成系统更新时，主要针对商品化微生物鉴定系统和药敏试验系统。而CNAS指南提供了包括显微镜检查、分离培养和鉴定、药物敏感试验等在内的各项微生物检验活动的验证要求及方案，其中CNAS指南CL42详尽列出了关于检验前、中、后的具体注意事项。我国临床微生物实验室可参考其中的差异，结合实验室的具体情况制定验证方案。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute. Verification of commercial microbial identification and antimicrobial susceptibility testing systems[S]. CLSI guideline M52-Ed1.Wayne, PA: CLSI, 2015.

[2]中国合格评定国家认可委员会. 临床微生物检验程序验证指南[Z]. CNAS-GL41: 2016.

[3]中国合格评定国家认可委员会. 医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明[Z]. CNAS-CL42: 2012.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute. Laboratory quality control based on risk management; approved guideline[S]. CLSI document EP23-ATM. Wayne, PA: CLSI, 2011.

[5]熊紫薇, 王新华, 易凯, 等. 临床微生物检验全面质量控制的应用体会[J]. 中国医药指南, 2016, 14(15)：286-287.

[6]徐月林, 李晓莉, 杨仁洪, 等. 临床微生物实验室药敏纸片片间均匀性差异的实时监测和药敏质控试验频率的动态调整[J]. 中国抗生素杂志, 2016, 41(6)：478-480.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-fifth informational supplement[S]. CLSI document M100-S25. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[8]Clinical and Laboratory Standards InstituteI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standards-twelfth edition[S]. CLSI document M02-A12. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standards-tenth edition[S]. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[10]US Food and Drug Administration. Procedures for class II device exemptions from premarket notification, guidance for industry and CDRH staff [S]. https://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/ucm080198.htm. Accessed July 22, 2015.

[11]US Food and Drug Administration. ClassⅡspecial controls guidance document: antimicrobial susceptibility test(AST) systems: guidance for industry and FDA[S].http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm080564.htm.Accessed July 17, 2015.

[12]Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices [J]. Clin Infect Dis, 2009, 49(11): 1749-1755.

(本文编辑：周万青，刘群)

北京市自然科学基金(7143182)；北京医院课题(BJ-2015-025)。

黄钰竹，1995年生，女，硕士研究生，研究方向为实验室质量管理。

王治国，E-mail:zgwang@nccl.org.cn。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.18

R446.5

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2017-02-06)