（南阳农业职业学院，河南 南阳 473000）

转基因艾美耳球虫作为疫苗活载体的研究进展

胡云，杨红玉

（南阳农业职业学院，河南 南阳 473000）

鸡球虫病（coccidiosis）病原为艾美尔属（Eimeria）球虫，是顶复门（Phylum Apicomplexa）原虫中的一大类，属于艾美尔科（Eimeriidae），艾美尔属（Eimeria）。鸡球虫病是危害养禽业最严重的疾病之一，每年给世界养禽业带来超过30亿美元的经济损失。

1 艾美尔球虫与动物机体的免疫

艾美尔球虫属于肠道上皮细胞内寄生性原虫，球虫感染宿主细胞后，在带虫空泡内完成体内发育阶段。早期研究认为带虫空泡是宿主免疫系统和球虫接触的屏障，弓形虫只允许分子量小于1 300 D的蛋白出入带虫空泡，而越来越多的研究表明，带虫空泡是球虫抗原与宿主接触的一种途径，带虫空泡膜与宿主的内质网膜融合，从而将带虫空泡内的抗原成分分泌至宿主胞浆。此外，子孢子、裂殖子和配子反复入侵肠黏膜上皮细胞，多次刺激宿主的免疫系统，也是宿主产生保护性免疫应答的重要因素。就是这种特殊的生活史导致虫体对肠黏膜上皮细胞的反复入侵，进而能激发机体产生坚实的保护性细胞免疫和黏膜免疫。

机体黏膜部位（如肠道、呼吸道、泌尿生殖道）能够通过多重机制保护宿主免受病原体的入侵：其固有的紧密结构如上皮细胞层间的连接和管腔的密闭微环境，为机体抵抗病原感染提供了机械性的保护屏障，但是仍有许多病原能够突破黏膜上皮的屏障，进入肠黏膜细胞激发特异性免疫反应；此外，在机体的黏膜部位，存在大量的抗原递呈细胞和淋巴细胞，T细胞经树突状细胞活化后，刺激B细胞分泌IgA抗体，后者能够对病原体发挥中和作用。

鸡球虫主要经肠道感染，能够激发宿主产生高效的黏膜免疫应答和细胞免疫。而禽流感、新城疫等禽类重要传染病也主要经肠道和呼吸道传播，这是设想利用转基因球虫防治禽流感、新城疫等禽类重要传染病的立脚点。病毒入侵机体后主要在消化道和呼吸道部位繁殖扩增，因而宿主产生的免疫分子和免疫细胞主要靶向消化道及呼吸道黏膜；而艾美耳球虫免疫能够诱导鸡产生以肠黏膜免疫应答为主的共同黏膜免疫反应，即肠黏膜部位的特异性的IgA+浆细胞和T细胞可趋化至呼吸道等其他黏膜部位，产生异位保护力。艾美耳球虫不同阶段的虫体反复入侵肠道细胞，这时如果表达外源蛋白，外源蛋白也会跟随虫体反复入侵肠细胞而激发强大的黏膜免疫和细胞免疫应答。因此研发出高效的黏膜免疫疫苗-转基因柔嫩艾美耳球虫疫苗有非常重要的意义。

黏膜部位微环境复杂，因此黏膜疫苗发挥效果困难重重，黏膜疫苗在进入黏膜部位递呈给抗原细胞之前要面临上皮层的机械屏障和各种蛋白酶的消化作用，因此迫切需要黏膜佐剂提高肠道部位对黏膜疫苗的免疫反应。霍乱毒素（Cholera toxin）和大肠杆菌不耐热肠毒素（E.coli heat-labile enterotoxin）是近几年来研究比较热的两种黏膜佐剂。这些新型黏膜佐剂的开发为防治经黏膜部位感染的传染病提供了无限前景。

2 转基因球虫作为疫苗活载体的优势

艾美耳球虫具有严格的宿主特异性，一种球虫只感染一种动物，而且球虫入侵肠道细胞后，仅仅在带虫空泡内发育，与宿主细胞核隔离，球虫的基因片段插入或整合进宿主基因组的可能性较小。

基因组容量大（约60Mb），可供外源基因的插入位点多。

艾美耳球虫为真核生物，可以对表达的外源蛋白进行糖基化修饰。这样表达出的外源蛋白能够更好地激发宿主免疫反应。

免疫原性强、可激发产生共同黏膜免疫反应：由于很多禽类重要传染病都是经肠道传播，而球虫疫苗在田间的保护率≥90%，艾美耳球虫能激发起高效的肠道黏膜免疫应答。因此转基因球虫可以在宿主发挥抗球虫免疫的同时，激发对其他病原的免疫反应，达到“一苗多用”的效果。自然饲养条件下卵囊可以重复感染，免疫一次即相当于多次预防接种。

球虫作为疫苗载体，可以口服接种，简单易行。因为卵囊壁能够保护它抵抗嗉囊和胃等酸性环境，不降低疫苗的活性。适用于群体饮水免疫或拌料免疫；球虫的繁殖周期较短，且感染属于自限性，在生成卵囊以后即排到体外，不会引起免疫耐受问题。

生物安全性高。鸡球虫各个种均以鸡为惟一宿主，不会跨种间传播，因此转基因球虫在田间的释放不造成所谓“散毒”的局面。

3 转基因艾美耳球虫作为疫苗活载体的研究进展

1998年英国的Tomley研究小组利用微线体1基因的调控序列作为启动子首次实现了以β-半乳糖基因（lacZ）为报告基因的柔嫩艾美耳球虫的瞬时转染，并观察到转染子孢子可以在MDBK细胞上发育到第一代裂殖子。开启了艾美尔球虫转基因研究的序幕。

2007年郝力力以球虫本身的序列为启动子，用黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白作为报告基因，以卵囊阶段提取的基因组DNA为模板，用PCR的方法，得到相关蛋白的启动子及肌动蛋白的下游调控序列。最终实现能够表达黄色和红色荧光蛋白的柔嫩艾美耳球虫的瞬间转染，转染后的子孢子在MDBK细胞上能够发育到第一代裂殖子。

2008年闫文朝首次利用荧光报告基因和药物筛选压力获得了能够稳定转染的艾美耳球虫系，并且获得了稳定表达黄色荧光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的转基因球虫系（TE1）。并对TE1繁殖力、致病力和免疫原性等生物学特性进行了研究。研究发现转基因球虫TE1卵囊孢子化后，1个卵囊内的4个孢子囊并非全部表达黄色荧光蛋白。球虫在合子减数分裂过程中存在同源或异源染色体重组和基因转换现象，使表达外源抗原基因的转基因球虫在传代递增过程中比例下降。

2008年刘贤勇通过引入限制性内切酶介导的整合技术（REMI）使球虫的转染效率提高了200倍，为转基因球虫的稳定筛选建立转基因球虫系奠定了良好的基础，他同时首次进行了转基因球虫系的安全性评估。

2011年黄骁舾建立了转基因艾美耳球虫激发的宿主免疫反应的检测平台，它建立的一株能够将黄色荧光蛋白打靶到微线中的转基因球虫能够激发宿主产生更高的淋巴细胞增殖反应和显著IgA反应，为转基因球虫成为新型疫苗载体展现了良好的前景。

2011年殷光文尝试在同一个质粒载体中将黄色荧光蛋白基因置于mic1启动子和actin的3′调控序列之间构建成一个表达框，而将红色荧光蛋白基因置于Actin的5′和3′调控序列之间构建成另一个表达框，成功地建立了双框表达载体，实现了不同外源蛋白同时表达，对转基因球虫成为新型活疫苗载体至关重要。

2012年Fiona M.Tomley和Damer P.Blake将空肠弯曲杆菌的保护性抗原CjaA转染到柔嫩艾美耳球虫中，建立了稳定表达空肠弯曲杆菌CjaA的转基因球虫系，将该球虫系免疫鸡后用空肠弯曲杆菌攻毒，结果发现转基因球虫免疫的鸡群能够抵抗空肠弯曲杆菌的感染。

4 存在的问题及未来发展趋势

尽管当前艾美尔球虫作为疫苗活载体的研究已经取得了一些突破性的进展，但是在转基因操作技术和转基因球虫的应用上仍然存在着很多问题。直接转染卵囊将成为未来的研究方向，它可以省去子孢子提取及外科手术途径接种等步骤，简单易行。

当前艾美耳球虫转基因的挑战还在于如何提高转染效率和提高转基因的表达效率，可以利用转座子元件进一步提高艾美耳球虫的转染效率，从而提高转基因成功的可能性。另外在艾美尔球虫转基因研究中将可能采用基于类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）、基于CRISPR/ Cas9的基因编辑技术等新的手段。

艾美耳球虫转基因研究取得的重要成就为其防治药物及疫苗的研发描绘了光明的前景，假以时日，基于转基因球虫的活载体疫苗将不仅能实现球虫病的有效防控，还有望成为预防畜禽其他重大疫病的多价疫苗。□