李昕键，吴 彻，雷小亚，严一铭，戴振凯，张新珩，蔺文成，陈伟国，陈 峰，谢青梅

(华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642)

鸡心包积液综合征病原的分离鉴定与进化分析

李昕键，吴 彻，雷小亚，严一铭，戴振凯，张新珩，蔺文成，陈伟国，陈 峰，谢青梅*

(华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642)

为确诊海南省某鸡场疑似心包积液综合征病例，于2016年5月从海南省某鸡场送检的病鸡中采集病料(肝脏、心脏)，研磨，通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，并进行鸡胚病变特征观察、禽腺病毒PCR特异性检测、基因测序和Blast序列比对。结果表明,接种鸡胚后5 d开始死胚，剖检可见胚体发育受阻，羽毛稀少，体表潮红，鸡胚皮肤表面有出血点；在病料研磨液、尿囊液及胚体肝脏中均检测到大小约为884 bp目的片段，将分离病毒命名为HN1605；hexon基因Blast序列比对及遗传进化分析结果表明，分离毒株与2015年山东和湖北报道的Ⅰ亚群腺病毒血清4型(FAV-4)SDSX、SDSX-15、SDNY2-15、HB1510和HBLF-15分离株亲缘关系最近。本研究表明，此次心包积液综合征病原是Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型病毒，该病毒依然危害着我国鸡群，疫情不断扩大，并呈现由我国北方地区向南方地区扩散的趋势。

心包积液综合征；禽腺病毒；分离；鉴定；序列分析

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)是一种无囊膜双链DNA病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其群特异性抗原可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个亚群[1]。Ⅰ亚群根据交叉中和试验又可分为12个血清型(FAV1-12),其中Ⅰ亚群FAV中血清4型和10型被认为是引起心包积液综合征、包涵体肝炎的主要病原[2-4]。心包积液综合征首先发生于1987年巴基斯坦的安卡拉地区[5]，随后在日本、印度、韩国等国家均有报道[3,6-8]，而心包积液综合征临床病例在我国的报道相对较少，只有少数FAV引起包涵体肝炎的报道[9-10]。2015年6月首先在我国山东地区肉鸡群暴发心包积液综合征疫情，随后在河南、辽宁、河北、江苏及湖北等[1,11-12]地区均出现该症状疫情报道，给我国肉鸡业造成了巨大经济损失。

2016年5月，从海南某大型鸡场送检疑似心包积液病死鸡中，采集病鸡肝脏、心脏等病料，通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，并进行鸡胚病变特征观察、禽腺病毒PCR特异性检测、基因测序和Blast序列比对，成功分离鉴定此次心包积液综合征病原是Ⅰ群禽腺病毒血清4型病毒，并对hexon基因进行遗传进化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和鸡胚 2016年5月，从海南省某鸡场送检3只病鸡采集肝脏、心脏、肺脏等病料。SPF鸡胚购自广东温氏大华农生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 PMD19-T质粒、大肠埃希菌DH5α感受态细胞、LATaq酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；病毒DNA抽提试剂盒、DNA Gel Extraction Kit ，Omega公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 向无菌采集的病料(肝脏、心脏等组织)加入含10 g/L双抗的PBS，在研钵中加入液氮充分研磨，反复冻融3次后，离心取上清液，0.22 μm滤器过滤除菌，采用卵黄囊接种至7日龄SPF鸡胚，0.2 mL /枚,置于37 ℃孵育，每日观察，连续观察7 d。弃去24 h内非特异性死亡鸡胚，收集24 h后死胚及尿囊液，7 d未死亡鸡胚及尿囊液，进行病毒检测。

1.2.2 病毒DNA提取 利用病毒DNA提取试剂盒，对病料研磨液、鸡胚尿囊液及鸡胚肝脏心脏研磨液提取DNA，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.3 引物设计及合成 根据GenBank公布的hexon基因序列设计用于特异性检测引物，上游引物：5′-CAAGTTCAGACAGACGGT-3′，下游引物：5′-TAGTGATGGCGGGACATCAT-3′，预计扩增片段884 bp。参考已报道Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型hexon基因设计扩增hexon全基因序列的引物，上游引物5′-ATGGCGGCCCTCACGCCCGAC-3′，下游引物：5′- GCCACAGGCAACGCCGTGTAA-3′，

预计扩增片段2 814 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.4 PCR特异性检测与hexon基因克隆 以1.2.2提取的DNA为模板，利用设计合成引物扩增hexon目的基因，采用25 μL体系，PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，12℃终止反应。PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳、回收后，克隆至pMD-19T载体上并转化到感受态DH5α，37℃培养箱过夜，挑取单个菌落进行PCR鉴定，阳性菌送交金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.5 序列分析 应用DNA Star.Lasergene.v 7.1分析软件对测序得到的基因序列进行拼接整理，在NCBI上进行Blast比对分析，并应用MEGA6.06分析软件进行基因的遗传进化分析。用于比较和分析参考序列均下载自GenBank：ON1(NC-015323)、HBLF-15(KU877420)、HB1510(KU587519)、SDSX(KT899325)、SDSX-15(KU877435)、SDNY2-15(KU877433)、SDXT2-15(KU877432)、Fowl adenovirus 10(U26211)、Phelps(U46933)、340(KC493646)、HG(GU734104)、A-2A(AF083975)、ATHEV(AY849321)、HEV(AF074946)、FJ12025(KF286430)、EDS/127(Y09598)、D11-JW-032(KJ452172)。

2 结果

2.1 鸡胚接种结果

病料接种7日龄SPF鸡胚后，24 h内未出现特异性死亡鸡胚，接种鸡胚后5 d～7 d陆续出现鸡胚死亡，剖检发现胚体发育受阻，羽毛稀少，体表潮红，鸡胚皮肤表面有出血点(图1)。

a.13 d正常鸡胚(未接种); b.13 d接种死亡鸡胚; c.14 d正常鸡胚(未接种); d.14 d 接种死亡鸡胚

2.2 PCR特异性检测结果

对病料研磨液和接胚后5 d～7 d收集的尿囊液及鸡胚肝脏心脏组织进行禽腺病毒PCR特异性检测，检测结果由图2和图3可知，在病料研磨液和5 d～7 d收集的尿囊液及鸡胚肝脏心脏组织中均扩增出与预期大小相符约为884 bp片段，且阴性、阳性对照成立，表明本研究成功分离得到1株禽腺病毒。

M.DNA标准 DL 2 000; PC.阳性对照;NC.阴性对照;1～3.病料M.DNA Marker DL 2 000; PC.Positive control;NC.Negative control；1-3.Samples

M.DNA标准DL 2 000; PC.阳性对照;NC.阴性对照; 1～6.接胚后5 d～7 d尿囊液和鸡胚肝脏M.DNA Marker DL 2 000; PC.Positive control;NC.Negative control; 1-6.The allantoic fluid and liver samples on day 5 to 7 post-infection

2.3 hexon基因同源性比较及遗传进化分析

HN1605分离株的hexon基因为2 814 bp(图4)，编码938个氨基酸残基。与GenBank上已发表的不同亚群禽腺病毒参考序列比对，Blast软件分析结果表明,HN1605分离株与Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型序列有较高同源性，其中2015年报道的同属于Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型的山东分离株SDXT2-15、SDSX、SDSX-15、SDNY2-15和湖北分离株HB1510、HBLF-15同源性高达99.9%以上，与2011年报道加拿大分离株ON1同源性为98.7%，与Ⅰ亚群禽腺病毒血清10型序列同源性为97.2%，而与Ⅰ亚群禽腺病毒血清1、5、8、9型同源性较低(69.3%～76.0%)，与Ⅱ亚群禽腺病毒的火鸡出血性肠炎病毒、Ⅲ亚群禽腺病毒的减蛋综合征同源性仅为49.8%～53.2%(图5)。

根据MEGA5.0软件绘制的遗传系统进化树，HN1605分离株与Ⅰ群腺病毒血清4型毒株处于同一进化分支，亲缘关系最近；与血清10型亲缘关系较近；而与Ⅱ群禽腺病毒参考毒株及Ⅲ群禽腺病毒参考毒株亲缘关系较远，明显属于不同的分支(图6)。

M.DNA标准 DL 5 000; 1.hexon基因

3 讨论

心包积液综合征是一种高度传染性疾病，主要发生在2周～4周的鸡群，造成20%～30%的病死率，与传染性法氏囊病、鸡新城疫、大肠杆菌病、网状内皮增生症、禽白血病、马立克病等病发生混合感染可导致较高死亡率，目前国内尚无有效疫苗[13]。本研究通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，接胚后5 d～7 d后开始陆续出现鸡胚死亡，鸡胚发育受阻，羽毛稀少，体表潮红，鸡胚皮肤表面有出血点，个别鸡胚肝脏呈现土黄色，与先前Ⅰ亚群禽腺病毒报道结果一致[9]。Ⅰ亚群腺病毒PCR特异性检测死胚尿囊液和心脏、肝脏均扩增出大小约884 bp目的片段；通过基因测序和Blast序列比对，最终确定此次心包积液综合征病原是Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型病毒。之前报道也表明许多造成心包积液的病原属于Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型，并且是高致病性的[4]。

图5 hexon基因同源性比对结果

图6 hexon基因遗传进化树

目前，该病毒的hexon基因是被研究最广泛的，Hexon蛋白是Ⅰ亚群腺病毒的主要结构蛋白，含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种属特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因，与致病性密切相关[14]。对hexon基因进行序列分析可进一步确定分离株属于FAV哪一个群，并区分同一各亚群的不同血清型[15]。本研究通过设计合成引物，对HN1605毒株hexon全序列进行扩增，与已报道禽腺病毒毒株进行比对，HN1605分离株与Ⅰ亚群腺病毒血清4型毒株处于同一进化分支，亲缘关系最近；与血清10型亲缘关系较近；而与Ⅱ亚群禽腺病毒火鸡出血性肠炎病毒参考毒株、及Ⅲ亚群禽腺病毒减蛋综合征参考毒株亲缘关系较远，明显属于不同的分支；通过对HN1605分离株hexon基因比对分析，进一步确定了本次分离毒株属于Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型。HN1605分离株hexon基因同源性分析表明，与国内2015年报道的的山东分离株SDXT2-15、SDSX、SDSX-15、SDNY2-15和湖北分离株HB1510、HBLF-15同源性高达99.9%以上，而HB1510和SDXT2-15等毒株同源性高达99.8%以上，说明HN1605分离株与上述分离株均来自同一毒株，且变异较小。与FAV-4参考毒株hexon基因核苷酸序列相比，HN1605分离株hexon基因有些核苷酸发生了突变，这些突变是否与病毒中和反应有关，是否影响病毒致病性仍需要进一步研究。本研究在海南省送检疑似心包积液综合征的病料中成功分离鉴定出1株Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型病毒，为进一步研究心包积液综合征病原奠定基础，同时也提醒我们，“安卡拉”病毒依然危害着我国鸡群，并且疫情呈现由我国北方地区向南方地区扩散的趋势，这应该引起行业内相关人士的密切关注。

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Isolation,Identification and Evolution Analysis of a Fowl Adenovirus Serotype 4 Strain from Chickens with Hydropericardium Syndrome

LI Xin-jian,WU Che,LEI Xiao-Ya,YAN Yi-ming,DAI Zhen-kai,ZHANG Xin-heng,LIN Wen-cheng,CHEN Wei-guo,CHEN Feng,XIE Qing-mei

(CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong，510642,China)

In this research,a fowl adenovirus serotype 4 strain named GD1605 was isolated and identified from livers and hearts of sick chickens in a farm of Hainan province in China,May 2016,based on SPF chicken embryo culture,chicken embryo pathological lesions,PCR assay,BLAST and sequence analysis.The results showed that each of inoculated chicken embryo appeared to be dead 5 d to 7d post inoculation and the death embryoes were observed as arrested development,feather scarce and skin hemorrhage.An avian adenovirus-specific PCR product (884 bp) was amplified and sequenced.The genetic evolution analysis results showed that the virus shared high identity with FAV-4 in group Ⅰ.The genetic evolution analysis also indicated that the virus was closely related to the FAV-4(group I) strains of SDSX,SDSX-15,SDNY2-15,HB1510 and HBLF-15.These results confirmed that the isolated virus is a member of fowl adenovirus serotype 4 in group Ⅰ,and causes hydropericardium-hepatitis syndrome.This virus still endangering chicken flocks in China,the epidemic expands unceasingly,and display the trend of epidemic from north to south regions in China.

Hydropericardium-hepatitis syndrome; Fowl adenovirus; isolation; identification; sequence analysis

2016-06-24

李昕键(1991-)，男，湖南常德人，硕士研究生，主要从事动物免疫与生物安全研究。*通讯作者

S852.659.1；S858.31

A

1007-5038(2017)02-0027-05