常丽贤，孙聪聪，陈晓娟，杨文钰，张家源，张英弛，袁卫平，竺晓凡

中国医学科学院 北京协和医学院 血液病医院血液学研究所，天津 300020

利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株

常丽贤，孙聪聪，陈晓娟，杨文钰，张家源，张英弛，袁卫平，竺晓凡

中国医学科学院 北京协和医学院 血液病医院血液学研究所，天津 300020

常丽贤, 孙聪聪, 陈晓娟, 等. 利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株. 生物工程学报, 2017, 33(2): 284–293.

Chang LX, Sun CC, Chen XJ, et al. Knocking out of humanDNAH2gene in U2OS cells by CRISPR/Cas9n double nick system. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 284–293.

基于CRISPR/Cas9n double nick技术构建人DNAH2(Homo sapiens dynein, axonemal, heavy chain 2) 基因敲除的U2OS稳定细胞株，旨在研究DNAH2基因的生物学功能。首先设计并合成A、B两个sgRNA (Single guide RNA) 以及各自的互补链，退火连接形成DNAH2 sgRNA-A、B双链，再分别与带有BbsⅠ粘性末端的pX462线性载体相连，形成pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B重组真核表达质粒。质粒共转染至U2OS细胞后，加入嘌呤霉素，以有限稀释法获得阳性单克隆细胞株，再以蛋白印迹实验检测DNAH2蛋白的表达，最后通过PCR-基因测序技术分析突变特点。结果显示A、B sgRNA双链成功插入pX462载体，U2OS-DNAH2-KO单克隆细胞株中DNAH2蛋白不表达，DNAH2基因发生移码突变，从而证实利用CRISPR/Cas9n double nick系统成功构建人DNAH2基因敲除的U2OS稳定细胞株，为研究DNAH2基因提供有利工具。

DNAH2，CRISPR/Cas9n，基因敲除，稳定细胞株

DNAH2(Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2) 基因可以编码DNAH2蛋白，后者主要表达于气管和睾丸部位，可参与精子鞭毛的组成，是呼吸道纤毛主要的动力产生蛋白[1-3]。DNAH2基因突变的患者可能会出现呼吸道抵抗力下降、反复呼吸道感染、支气管扩张症等症状[2-4]。范可尼贫血 (Fanconi anemia，FA) 是一种主要由FA基因纯合或复合杂合突变引起的常染色体或X连锁隐性遗传性疾病[5-7]。目前已发现并克隆出多个可致范可尼贫血的突变基因(如FANCA、FANCB、FANCD1、FANCD2等)[5-6]。……