张雪，孙鑫博，樊波，张胤冰，韩烈保，许立新*

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生长调控重点实验室，河北农业大学，河北 保定 071001)

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

张雪1，孙鑫博2，樊波1，张胤冰1，韩烈保1，许立新1*

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083；2.河北省作物生长调控重点实验室，河北农业大学，河北 保定 071001)

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶，其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板，利用同源克隆法，从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因，该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示：ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白，定位于细胞质中，含有CSD蛋白家族特有的保守结构域，具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点；与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性，进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式，结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达，叶中表达量最高；干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd2+胁迫(200 mg/L Cd2+)均能诱导ZjCSD基因表达量上调，Pb2+胁迫(1 g/L Pb2+)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。

结缕草；CSD；生物信息学；逆境胁迫；实时荧光定量PCR

植物在正常生命活动中会产生较低水平的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS是细胞中重要的信号传导分子，参与激素传导、生物和非生物胁迫应答及植物生长发育过程的调控等[1]。然而在干旱、极端气温、重金属污染和盐害等逆境胁迫下，细胞中会积累过量的ROS，对脂质、核酸和蛋白质造成氧化损伤，进而引起代谢异常和生物膜结构功能损坏等[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)等抗氧化酶的协同作用能够清除过量的ROS，保护植物细胞免受损伤[3]。其中，SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，是防御ROS的第一道防线。SOD是一种几乎存在于所有需氧生物的金属酶，根据活性中心所含金属辅基的不同分为Mn-SODs、Cu/Zn-SODs、Fe-SODs、Co-SODs和Ni-SODs等类型[4]。高等植物主要含有Mn-SODs、Cu/Zn-SODs、Fe-SODs三类。其中，Cu/Zn-SOD(CSD)在植物体内含量最丰富，主要在细胞质、叶绿体、细胞核中发挥作用。

大量研究表明，在逆境胁迫下，植物能够通过提高体内SOD的表达量来增强抗逆性。如曲亚楠等[5]报道在高温和干旱胁迫下，匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)体内SOD等抗氧化酶的活性较对照植株显著上升；樊瑞苹等[6]研究表明高羊茅(Festucaarundinacea)在盐胁迫时，体内SOD活性明显高于对照植株。由玉米(Zeamays)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等植物中克隆获得的SOD基因，通过转基因技术转化不同的受体植物，得到SOD酶活增强的转基因植株，进一步验证了SOD与植物抗逆性密切相关。如Xu等[7]报道，过表达CSD和APX基因的木薯(Manihotesculenta)在冻害下叶片萎蔫程度明显小于对照植株，且SOD含量是对照植株的1.5倍；张海娜等[8]研究表明过表达小麦(Triticumaestivum)CSD的烟草相比对照植株对盐胁迫的耐性更强。

结缕草(Zoysiajaponica)隶属禾本科画眉草亚科结缕草属，抗逆性较强，具有较高的坪用价值，因而广泛应用于城市绿地、运动场草坪、水土保持及道路护坡等方面。目前，CSD基因已从多种植物中克隆获得并进行了表达分析和功能验证，但关于结缕草CSD基因的克隆及表达模式还未见详细报道。本研究通过同源克隆获得了结缕草CSD基因，利用生物信息学方法分析其序列特性，并采用实时荧光定量PCR检测了其在多种逆境胁迫下的表达模式。对结缕草CSD基因的研究有利于进一步了解CSD基因在植物应对逆境胁迫过程中的功能，同时为草坪草抗逆育种的分子机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料的培养及处理

以结缕草品种‘Zenith’为材料，播种于直径20 cm的花盆中，培养基质为沙土、草炭和蛭石(1∶1∶1)，在温度30/25 ℃(昼/夜)、光照强度80 μmol/(m2·s)、光周期16/8 h(光/暗)、相对湿度65%的环境中培养，期间进行正常的养护管理。出苗后8周左右分别用150 mmol/L NaCl、30% PEG、200 mg/L Cd2+、1 g/L Pb2+处理材料，处理后分别于0、2、4、8、12、24和48 h取结缕草叶片，用于不同胁迫下的表达分析，每个处理设置3个重复。取未经任何处理的结缕草植株的根、茎和叶，用于不同组织的表达分析，重复3次。取样后立即将样品置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 总RNA的提取及反转录

采用Trizol总RNA提取试剂盒(Invirogen，美国)提取结缕草各组织总RNA，用Nanodrop 2000检测浓度及纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。采用5×All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)试剂盒(abm，加拿大)去除基因组DNA，并反转录合成cDNA。储存于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物设计与合成

通过local blast检索结缕草转录组数据库，获得与拟南芥铜锌超氧化物歧化酶基因AtCSD(AT1G08830)同源性最高的基因，转录组序列号为comp215676_c0，该基因是一段长度为928 bp的cDNA序列。将该基因与亲缘关系较近的禾本科模式植物玉米和水稻的CSD基因序列(分别为NM_001320832、D01000)进行比对发现它们具有很高相似度。利用BioXM 2.6软件分析结缕草comp215676_c0基因序列，发现其含有一个长度为459 bp的开放阅读框(ORF)，根据ORF序列设计特异性引物，上游引物CSD-F：5′-ATGGGGAAAGCTGTCGCTGT-3′，下游引物CSD-R：5′-ACCCTGGAGCCCAATGATCC-3′，以结缕草cDNA为模板进行扩增，目的片段大小459 bp。根据该ORF序列，利用在线工具IDT(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)设计荧光定量PCR所用特异性引物，上游引物CSD-qF：5′-CGGAAGATGAGAACCGCCAT-3′，下游引物CSD-qR：5′-TCCAATGATCGAGTGCGGTC-3′，目的片段大小为82 bp；内参基因根据ZjActin基因序列设计特异性引物ZjActin-F：5′-GCTCAGTCCAAGAGAGGTATTC-3′和ZjActin-R：5′-TGATGCCAGATCTTCTCCATATC-3′。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.4 目的基因克隆

以结缕草cDNA为模板，对目的基因进行PCR扩增。反应体系为：rTaq酶0.5 μL，dNTP 1 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10×buffer 2 μL，灭菌超纯水13.5 μL补齐至20 μL。反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA，美国)对目的片段进行回收纯化，与pT-Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选和菌液PCR验证插入片段，选取有目的条带的菌液样品送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，采用Sequencher软件进行序列分析。

1.5 生物信息学分析

本研究使用的主要生物信息学分析工具如下：利用ExPASy Protparam分析蛋白质的基本理化性质(http://web.expasy.org/protparam)；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)预测蛋白质N-末端信号肽和亚细胞定位情况；利用TMHMM 2.0预测蛋白质跨膜区段(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)；利用ExPASy工具中的SOPMA软件预测蛋白质二级结构；利用DNAMAN软件进行多序列比对，并结合MEGA 5.0软件(Neighbor-Joining，NJ，邻位相连法)构建氨基酸序列的分子系统进化树。利用miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)预测ZjCSD基因上游的miRNA。

1.6 基因表达分析

采用CFX96型实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系为：cDNA模板3 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG(abm，加拿大)10 μL，灭菌超纯水6 μL补齐至20 μL。反应程序为：50 ℃ 2 min，94 ℃10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个处理设3个重复。根据gene expression值进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 结缕草ZjCSD基因的克隆与序列分析

以结缕草cDNA为模板，CSD-F和CSD-R为引物扩增目的基因。所得目的片段大小与预测大小基本一致，扩增片段经切胶回收后连接至克隆载体测序，测序结果通过Sequencher软件与预测序列进行比对，结果显示扩增片段序列与预测序列完全一致。该基因ORF长459 bp，编码152个氨基酸(图1)，利用NCBI Conserved Domains Search分析其编码的氨基酸序列，结果表明该基因编码的蛋白质含有CSD家族基因的保守结构域，属于CSD超级家族，具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点(图2)，因此认为该基因是CSD同源基因，命名为ZjCSD，并将该基因在GenBank中登记注册(accession No. KX925930)。

2.2 结缕草ZjCSD蛋白特性分析

利用在线工具Prot param预测ZjCSD蛋白的基本理化性质，结果表明ZjCSD蛋白相对分子量为15.0836 kD，蛋白分子式为C644H1029N197O216S3，总原子数为2089，蛋白负电荷残基(Asp+Glu)总数15，正电荷残基(Arg+Lys)总数为9，理论等电点5.76；由18种氨基酸组成，其中Gly占19.7%，比例最高；该蛋白N末端为Met，半衰期为30 h，蛋白质不稳定指数(instability index)为14.50(稳定系数>40时不稳定)，脂溶指数(aliphatic index)为77.63，总平均疏水指数(grand average of hydropathicity，GRAVY)为-0.257，因此推测该蛋白是稳定的、酸性、亲水脂溶蛋白。

利用TMHMM 2.0在线工具预测ZjCSD蛋白的跨膜结构域，结果表明ZjCSD蛋白无跨膜螺旋，整条肽链都位于膜外；利用在线工具SignalP 4.1对ZjCSD蛋白的信号肽进行预测，结果显示ZjCSD蛋白N端不含信号肽，为非分泌蛋白；利用TargetP 1.1对ZjCSD蛋白进行亚细胞定位预测，结果表明ZjCSD蛋白位于细胞质中。综上推测ZjCSD蛋白是位于细胞质中的非分泌蛋白，合成后不进行蛋白质的外运。

用在线工具SOPMA对结缕草ZjCSD蛋白的二级结构进行预测，结果显示该蛋白包含51.32%无规则卷曲(random coil)、31.58%延伸链(extended strand)、4.61%α-螺旋(alpha helix)和12.5%β-转角(beta turn)，由此可见ZjCSD蛋白的二级结构中无规则卷曲和片层结构占大部分。

图1 ZjCSD cDNA的核苷酸序列及编码的氨基酸Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino-acid of ZjCSD 双下划线表示起始密码子和终止密码子。Double underline denotes the initiation codon and the termination codon.

图2 ZjCSD蛋白的保守结构域Fig.2 Putative conserved domains of ZjCSD

2.3 结缕草ZjCSD的氨基酸同源性和系统进化分析

将结缕草ZjCSD基因编码的氨基酸序列在NCBI中进行Blast相似性分析，并用DNAMAN软件进行序列比对，发现ZjCSD与其他多种植物的CSD氨基酸序列存在较高相似性，其中，与玉米CSD相似性达91%，与二穗短柄草、獐茅、欧洲大叶杨等相似性在85%～89%。此外，氨基酸序列的不同区段保守程度不同，N端序列同源性程度低于C端序列，C端序列较N端序列保守性更高(图3)。

图3 ZjCSD与其他物种相似蛋白的多重比较Fig.3 Multiple sequence alignment of ZjCSD and CSD from other species

结合同源性分析结果，利用MEGA 5.0软件，采用邻近相接法(Neighbor-Joining)，bootstrap验证重复1000次，构建结缕草、玉米、小米等16个物种CSD氨基酸序列的系统进化树(图4)。结果显示，日本结缕草CSD蛋白与小米、玉米等禾本科植物的CSD蛋白遗传距离较近，聚为一类，而同属百合科植物的宫灯百合和大蒜聚为一类，同属茄科植物的番茄和马铃薯聚为一类，同属十字花科植物的萝卜和拟南芥聚为一类，同属豆科植物的蔓花生和落花生聚为一类，同属杨柳科植物的欧洲大叶杨和胡杨聚为一类，由此可见不同植物CSD蛋白的进化关系具有明显的种属特征。

2.4 结缕草ZjCSD基因上游miRNA预测

在miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中，将ZjCSD基因序列与miRNA进行比对，结果表明，ZjCSD基因5′-UTR第152～172位碱基中的18个碱基，与拟南芥、水稻、大豆(Glycinemax)、欧洲大叶杨、葡萄(Vitisvinifera)等多种植物miR398中含有的同源序列5′-acacaagaguccaguggggaa-3′重叠(图5)。并且，已有报道证明了在拟南芥[9]、水稻[10]等多种植物中CSD基因是miR398的靶基因之一，因此推测结缕草中miR398也可能与ZjCSD基因存在相互作用，作用位点位于ZjCSD基因的5′-UTR。

图4 ZjCSD蛋白与其他物种CSD蛋白氨基酸的系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of ZjCSD and CSD from other species节点处的数字表示bootstrap验证重复1000次该节点可信度的百分比。 The number on the brunch represents the reliability percent of bootstrap value based on 1000 replications.

图5 ZjCSD与其他物种miR398作用位点Fig.5 The action site between ZjCSD and miR398 from other species

2.5 结缕草ZjCSD基因表达分析

对结缕草植株的不同组织进行荧光定量RT-PCR分析，结果显示，ZjCSD基因在结缕草的根、茎、叶中均有表达，但表达量存在差异(图6)。叶中表达量最高，约为茎的4倍，根中表达量最低，约为茎的0.7倍。采用实时荧光定量RT-PCR分析结缕草叶片中ZjCSD基因在不同胁迫下的表达，结果显示(图7)：在PEG(A)处理2～48 h条件下，ZjCSD基因的表达量在2 h时开始上升，在4 h时达到最大值 ，约为0 h表达量的4.0～4.5倍；8～12 h表达量有所下降，为0 h表达量的2倍左右，24 h后表达量恢复为0 h水平。在NaCl(B)处理条件下，ZjCSD基因的表达量在4 h时迅速升高并达到最大值，约为0 h后表达量的10.5～11.0倍，8 h后表达量下降，24 h时恢复为0 h水平。在Cd2+(C)处理条件下，ZjCSD基因的表达量也呈现先上升后下降的趋势，4 h时表达量达到最大值，大约是对照(0 h)的3.0～3.5倍，8 h后表达量下降，但仍高于0 h水平。在Pb2+(D)处理条件下，ZjCSD基因的表达量在2～8 h下调，12 h时恢复为0 h水平，24 h表达量下降，48 h表达量又恢复至0 h水平，总体表达量均低于或基本持平于对照。

图6 ZjCSD基因的组织特异性表达Fig.6 Tissue-specific expression of ZjCSD

图7 不同胁迫下ZjCSD基因在结缕草叶片中的表达Fig.7 The expression of ZjCSD in leaf under different stresses A：干旱(PEG)胁迫Drought stress；B：盐(NaCl)胁迫Salt stress；C：Cd2+胁迫Cd2+ treatment；D：Pb2+胁迫Pb2+ treatment.

3 讨论

本研究从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草铜锌超氧化物歧化酶基因ZjCSD，利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行比对分析后，发现其含有CSD基因家族特有的高度保守的金属离子结合区， Cu2+与His45、His47、His62、His119 位相结合，Zn2+与His62、His70、His79、Asp82 位相结合；C端序列较N端序列保守性更高，验证了Lee等[11]提出的CSD蛋白抵抗外界氧化胁迫的主要功能区域或结构区域位于C端的推断。

miRNA是一类较短的内源非编码RNA，通过降解mRNA或翻译抑制在转录后水平调控基因的表达。在植物胁迫响应过程中扮演重要角色[12]。miR398是近期在拟南芥、水稻、苜蓿(Medicagotruncatula)等多种植物中发现的响应多种生物和非生物胁迫的miRNAs之一，包括铜缺乏[13]、ABA胁迫和盐胁迫[14]、紫外线胁迫[15]、氧化胁迫等[16]。在拟南芥中，miR398靶向胞质CSD1和质体CSD2基因，还靶向COX5b-1和CCS1基因。植物的miRNA靶位点主要位于mRNA的蛋白编码区[17]。miR398与CSD2和CCS1的互补位点位于mRNA的编码区[9,18]，但与CSD1和COX5b-1的互补位点位于5′-UTR[19]。本研究通过生物信息学分析，首先预测了ZjCSD基因定位于细胞质中，随后预测了ZjCSD上游的miRNA之一是miR398，且两者互作位点位于ZjCSD基因的5′-UTR。通过生物信息学预测得到的结论与拟南芥中结论相似，因此推测结缕草miR398也能调控ZjCSD的表达，但仍需进一步通过实验验证。

干旱、盐害和重金属等逆境胁迫诱导植物体内活性氧的积累，造成植物氧化损伤。SOD作为抗氧化酶系统的第一道防线，能够清除过多的活性氧，在植物抵御氧化损伤中发挥重要作用。许立新[20]在对草地早熟禾(Poapratensis)干旱及干旱后复水恢复机理的研究中发现，干旱胁迫下，CSD基因的表达量显著提高，且抗旱性较强的品种相比抗旱性较弱的品种CSD基因的表达水平更高，类似的结论在白三叶(Trifoliumrepens)中也得到了验证[21]。盐胁迫能够诱导CSD基因的转录水平提高已在包括烟草[22]、百脉根(Lotuscorniculatus)[23]、秋茄(Solanummelongena)[24]等多种植物中得到验证。本研究中，用PEG、NaCl分别处理结缕草48 h，ZjCSD基因的表达整体均呈现先升高后降低的趋势，说明干旱胁迫和盐胁迫均能诱导ZjCSD基因表达上调，与前人研究结果一致。

重金属胁迫会导致植物的生物量减少，叶片失绿，根系生长受到抑制，形态发生改变，甚至死亡[25]。在重金属污染物中，镉(Cd)由于迁移性强，易被植物吸收富集进入食物链，威胁人畜健康，因而是重金属污染物中危害性最大的一种[26]。大量研究表明，植物能够通过调节SOD基因的表达水平来抵抗Cd胁迫。张玉秀等[27]报道，100 μmol/L Cd2+能够诱导龙葵(Solanumnigrum)幼苗CSD基因的表达上调，Luo等[28]用0.2和0.5 mmol/L的Cd2+处理多年生黑麦草(Loliumperenne)7 d，结果表明，4～24 h内CSD基因表达量提高。本研究中，Cd2+处理条件下ZjCSD基因的表达量上升，与前人研究结果相符。Pawlak等[29]研究表明，在大豆幼苗根系中，Pb2+浓度为150～350 mg/L时，CSD基因 mRNA量明显低于对照。本研究中，Pb2+处理0～48 h内，ZjCSD基因的相对表达量总体低于或持平于对照表达量水平，与大豆幼苗根系在较高浓度Pb2+处理下CSD基因表达量下调的情况相符。由Cd2+处理诱导ZjCSD表达量上升而Pb2+处理诱导ZjCSD表达量下降的事实可以推测，ZjCSD基因对Cd2+和Pb2+的响应模式和调控机制不同。造成上述差异的原因之一可能是这两种金属具有不同的化学性质，其中Cd可以替代转录因子锌指结构中的Zn配合物，并在一定程度上作为转录激活因子发挥作用[30]，但具体原因仍需进一步探究。综上，ZjCSD基因在重金属胁迫下的表达调控机制十分复杂，不同的重金属元素有不同的调控机制，详细的机理有待进一步研究。

4 结论

本研究从结缕草中克隆获得了结缕草铜锌超氧化物歧化酶基因，命名为ZjCSD。该基因含有完整的ORF，编码152个氨基酸。ZjCSD基因编码的蛋白含有CSD家族特有的保守结构域，具有典型的金属结合位点。ZjCSD基因在叶中表达量最高；在干旱胁迫、盐胁迫和Cd2+胁迫下表达量上调，在Pb2+胁迫下表达量下调。因此，推测ZjCSD基因参与结缕草抵抗干旱、盐和重金属胁迫的过程，并在其中发挥一定功能。

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Molecular cloning and expression analysis ofZjCSDfromZoysiajaponica

ZHANG Xue1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo1, ZHANG Yin-Bing1, HAN Lie-Bao1, XU Li-Xin1*

1.InstituteofTurfgrassScience,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China; 2.KeyLaboratoryofCropGrowthRegulationofHebeiProvince,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China

Copper/zinc-superoxide dismutase (CSD) is a key enzyme involved in the plant response to abiotic stress. Its content and activity is closely related to the stress tolerance of plants. TheZjCSDgene was isolated from the transcriptome database ofZoysiajaponicaby homologous cloning. It encoded a protein of 152 amino acid residues. Bioinformatics analysis revealed that the protein encoded byZjCSDgene was stable, hydrophobic, acidic, fat-soluble, and located in the cytoplasm. With typical Cu2+and Zn2+binding sites,ZjCSDbelonged to the plant SOD super family. A homology analysis based on the deduced amino sequence indicated thatZjCSDhad a closer relationship with CSD from Setaria italica and Zea mays than with CSDs from other plants. The expression profiles ofZjCSDin different tissues and under different stress treatments were investigated by qRT-PCR. Transcripts ofZjCSDwere detected in the root, stem, and leaf. The highest transcript levels were in the leaf. TheZjCSDmRNA levels were up-regulated by salt, drought, and cadmium stress, and down-regulated by lead stress. These results suggested thatZjCSDmight play a role in drought, salt, and heavy metal stress tolerance inZ.japonica.

Zoysiajaponica;CSD; bioinformatics; abiotic stress; qRT-PCR

10.11686/cyxb2016260

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-27；改回日期：2016-11-04

中国林学会——青年人才托举工程项目和国家高新技术研究发展计划项目(2013AA102607)资助。

张雪(1991-)，女，山东烟台人，在读硕士。E-mail: zhangxuenearyuki@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: lixinxu@bjfu.edu.cn

张雪, 孙鑫博, 樊波, 张胤冰, 韩烈保, 许立新. 结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析. 草业学报, 2017, 26(2): 102-110.

ZHANG Xue, SUN Xin-Bo, FAN Bo, ZHANG Yin-Bing, HAN Lie-Bao, XU Li-Xin. Molecular cloning and expression analysis ofZjCSDfromZoysiajaponica. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 102-110.