隋雨桐，李泽光，朱明雪，兰辛键，闫起，梁华*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

实 验 研 究

四君子汤对自然衰老小鼠干预作用的代谢组学研究

隋雨桐1，李泽光2，朱明雪1，兰辛键1，闫起1，梁华1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究四君子汤干预自然衰老小鼠内源性代谢物的变化，探索与衰老密切相关的代谢物、代谢通路及其四君子汤调节作用。方法：选取自然衰老小鼠，检测小鼠血清SOD、MDA及NO；利用UPLC-HDMS技术，对自然衰老小鼠血清进行模式识别分析。结果：模型组小鼠血清SOD和NO含量显著下降，MDA含量升高；四君子汤可显著提高血清中SOD含量，显著降低血清中MDA含量。确定25个可能与衰老相关的生物标记物和3条代谢通路。发现四君子汤对一些标记物如亮氨酸、血栓素、花生四烯酸、谷胱甘肽等，具有明显的回调作用。结论：通过代谢组学的研究方法发现四君子汤通过调节亮氨酸、血栓素、花生四烯酸、谷胱甘肽等标记物，对衰老起到了干预作用。

衰老；代谢组学；四君子汤

代谢组学(metabolomics)效仿组学的研究思路，以机体代谢轮廓进行分析为基础，通过对内源性小分子定性定量分析，研究机体被外界刺激后，小分子物质的整体扰动，探究生物体系的代谢途径，其研究对象是小分子物质[1]。“方证相关”是中医辩证论治思想，指药方与对应病证具有高度的相关性[2]。“证”是对疾病过程中某一阶段的病理状态，也是人体代谢内源性物质变化的客观反映。仪器测定并分析中药方剂对代谢标记物的影响是运用现代科学语言表达中医药特性的新思路[3]。

衰老是生物体在生命后期阶段所出现的全方面退化的过程[4]。中医关于衰老有多种学说，如脏腑虚衰学说、阴阳失调学说、精气亏耗等学说[5-7]。四君子汤是由人参、白术、茯苓、甘草组成的经典补益方，具有益气健脾之功效。研究表明[8-9]四君子汤具有一定的抗衰老和延缓衰老作用。本实验采用代谢组学的研究方法，对四君子汤干预作用下自然衰老小鼠血清内源性小分子代谢物质的变化进行研究，探索与自然衰老密切相关的生物标记物、代谢通路及四君子汤的干预作用，为四君子汤与衰老(气虚证)相关生物学基础提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

亮氨酸脑啡肽(SIGMA技术有限公司，美国)；色谱甲醇(赛默飞世尔公司，美国)；色谱乙腈(赛默飞世尔公司，美国)；甲酸(北京迪马科技欧泰科技发展中心，中国)；NO试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)。

1.2 仪器

Waters AcquityTMUPLC液相色谱仪；Waters LCT Premier XE TOF质谱仪；电子分析天平AL204(上海梅特勒托利多仪器有限公司，中国)；微量移液器(上海新汉计量器具技术研究所，中国)；KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司，中国)；漩涡混合器(其林贝尔仪器制造有限公司，中国)。

1.3 动物

SPF级ICR雄性小鼠30只，3月龄雄性小鼠10只，12月龄雄性小鼠20只，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。饲养温度(22±2)℃，湿度55%±15%，自由摄食饮水，于饲养笼适应一周后开始实验。

1.4 药品的制备

四君子汤：人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g。药材由黑龙江中医药大学国医堂提供。煎液并浓缩药液至100 mL，药液浓度为0.33 g/mL，给药体积为13 mL/kg，给药剂量为4.29 g/kg，给药时间为每日上午8：30～9:30，给药30 d。

1.5 样品采集与制备

将各组小鼠于给药的第30天禁食。次日摘取眼球取血，静置6 h，于4℃离心，3 500 rpm，15 min，取上清液，即为待测血清。置于-80℃冰箱备用。

自然解冻小鼠血样，取200 μL血清，加入1 000 μL甲醇，涡旋3 min，于4℃离心，12 000 rpm，15 min，取上清液再重复该条件离心1次，取上清液200 μL，供UPLC-MS分析。

1.6 分析条件

1.6.1 液相条件

色谱柱Acquity UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1×50 mm Column)(Waters公司，美国)；流速0.4 mL/min；柱温40℃；样品仓温4℃；流动相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸-超纯水溶液；梯度洗脱条件：0 min，2%A，98%B；15 min，100%A，0%B。

1.6.2 质谱条件

正电喷雾离子源(ESI)：毛细管电压1 300 V；样本锥孔电压60 V；负电喷雾离子源(ESI)：毛细管电压1 500 V；样本锥孔电压70 V。

脱溶剂温度350℃；离子源温度110℃；脱溶剂气体流速750 L/h；锥孔气体流速20 L/h。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液(Leucine-Enkephalin，[M+H]+556.2771)为锁定质量溶液。质量扫描范围为m/z：100～1 500。

1.7 数据处理

将数据导入Markerlynx V4.1软件进行数据分析。利用Progenesis QI 2.1软件进行色谱峰识别及峰匹配，进一步利用EZnifo软件模块对各组小鼠血液代谢轮廓数据进行PCA分析、OPLS-DA分析等。

2 结果

2.1 生化指标研究

检测小鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)。模型组与空白组相比，模型组小鼠SOD含量降低，且具有极显著差异(P<0.01)，NO含量降低，且具有显著差异(P<0.05)，MDA含量升高，且具有极显著差异(P<0.01)；治疗组与模型组相比，小鼠血清中SOD含量升高，且具有极显著差异(P<0.01)；MDA含量降低，且具有显著差异(P<0.05)；NO含量升高，但差异不具有显著性(见表1)。

表1 小鼠血清SOD、MDA及NO的测定结果

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 代谢组学研究

2.2.1 衰老小鼠血液生物标记物的鉴定

将空白组和模型组血液样本进行正负离子模式全扫描，并对空白组和模型组小鼠血液代谢轮廓数据进行OPLS-DA分析，得到Score Plot 、VIP-Plot、S-Plot图(图1，2，3)，从而找到对代谢轮廓变化起关键性作用的内源性代谢物。基于P值小于0.05作为筛查条件，对VIP贡献值大于2的潜在生物标记物进行分析，确定内源性生物标记物。采用UPLC-HDMS的方法检测标记物，在HMDB及KEGG等检索数据库进行检索并结合Progenesis QI 2.1软件进行化合物鉴定。共得出衰老相关的25个可能的潜在生物标记物(见表2)。

图1 空白组、模型组小鼠血清样品OPLS-DA模式识别分析后Score Plot图A.正离子模式；B.负离子模式

2.2.2 四君子汤体内成分组方对衰老的调节作用

利用UPLC-HDMS得到空白组、模型组、治疗组质谱代谢轮廓图，进一步利用Progenesis QI 2.1软件进行质谱离子信息获取，将代谢轮廓数据进行PCA分析 (图4)，结果显示组间区分良好，四君子汤干预组接近空白组并远离自然衰老模型组。在衰老模型小鼠血液25个生物标记物中，治疗组对其中7个具有调整作用，其中1个具有统计学意义，分别是L-Leucine、3L,7D,11D-Phytanic acid、Galactosylceramide (d18:1/14:0)、S-(PGA2)-glutathione、1,25-Dihydroxyvitamin D3-26,23-lactone、Ercalcitriol、3b,7a,12a-Trihydroxy-5a-Cholanoic acid(图5)。将鉴定得到的血液7个具有调整作用的生物标志物进行MetPA分析，得到3个代谢通路，分别是Valine, leucine and isoleucine biosynthesis、Valine, leucine and isoleucine degradation、Aminoacyl-tRNA biosynthesis。以上结果说明四君子汤对自然衰老相关代谢通路具有调节作用(图6)。

图2 空白组、模型组小鼠血液样品OPLS-DA模式识别分析后VIP散点图A.正离子模式；B.负离子模式

图3 空白组、模型组小鼠血液样品OPLS-DA模式识别分析后S-Plot图A.正离子模式；B.负离子模式

Nom/zRtAdductsCompoundIDFormulaDescriptionTrendVIP1132.10191.36M+H,2M+HHMDB00687C6H13NO2L-Leucine↓2.282952330.336810.59M+NH4HMDB00553C20H40O23L,7D,11D-Phytanicacid↓3.794333400.343911.15M+NH4HMDB11544C23H42O4MG(0:0/20:2(11Z,14Z)/0:0)↓2.489854152.045912.52M+NaHMDB11664C9H7N3-Methylene-indolenine↓9.224715689.56213.65M+NH4HMDB12321C38H73NO8Galactosylceramide(d18:1/14:0)↑2.716666315.302514.2M+H,M+NH4,2M+HHMDB13648C18H35NO2PalmitoleoylEthanolamide↑2.691667319.287914.21M+NaHMDB03208C20H40OThromboxane↑2.619118635.445914.21M+NaHMDB07335C39H64O5DG(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18:2(9Z,12Z)/0:0)↑2.512079661.466514.36M+NaHMDB56176C41H66O5DG(16:1n7/0:0/22:6n3)↑2.1359910439.26946.12M+FA-H,2M-H,2M+FA-H,M-HHMDB12530C23H38O511-Hydroxyeicosatetraenoateglycerylester↑3.4773311453.28597.71M+FA-H,2M-H,M-HHMDB00505C24H40O5Allocholicacid↑3.6402312602.301510.19M-HHMDB60144C29H41N5O9Neocasomorphin(1-5)↓4.7523113629.321710.19M+FA-HHMDB02577C30H48O11Cholicacidglucuronide↓3.6807214295.227510.34M-H,M+FA-HHMDB04670C18H32O3Alpha-dimorphecolicacid↓2.7076715571.289710.5M+FA-HHMDB00739C24H40N5O8+Isodesmosine↓2.0896316343.229610.71M-H,M+FA-H,2M-HHMDB60049C22H32O34-HDoHE↓6.9117317319.228810.82M-H,M+FA-HHMDB02232C20H32O38,9-Epoxyeicosatrienocacid↓5.4494518819.549712.12M+FA-HHMDB10647C42H79O10PPG(18:2(9Z,12Z)/18:0)↓2.0395819640.291812.24M-HHMDB13062C30H47N3O10SS-(PGA2)-glutathione↑2.6716220887.552312.512M-HHMDB00969C27H40O51,25-DihydroxyvitaminD3-26,23-lactone↑2.5213321349.238313.25M+FA-H,2M-H,M-HHMDB01043C20H32O2Arachidonicacid↓2.6837322403.157113.252M+FA-HHMDB02030C6H13NO5Fructosamine↓2.4863423855.632414.062M-HHMDB06225C28H44O3Ercalcitriol↑2.4837224815.551814.192M-HHMDB00376C24H40O53b,7a,12a-Trihydroxy-5a-Cholanoicacid↑3.427125505.336614.35M+FA-HHMDB12555C29H48O413'-Carboxy-alpha-tocopherol↓2.9915

注：↑表示12月与3月比较，12月组表达水平较3月组上升，↓表示12月与3月比较，12月组表达水平较3月组下降

图4 空白组、对照组及治疗组小鼠血液样品PCA模式识别分析后Score Plot图A.正离子模式；B.负离子模式

图5 空白组、模型组及治疗组小鼠的血液生物学标记物变化与3月空白组比较，*P<0.05，**P<0.01;与12月模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

图6 基于MetPA对治疗组小鼠具有调整作用的生物标志物分析1.缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；2.缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解;3.氨酰tRNA生物合成

3 讨论

本研究选取自然衰老小鼠作为实验动物模型。MDA是脂质过氧化反应的终产物，机体内MDA反映机体内脂质过氧化的程度，能够反映细胞损伤的程度。故MDA是评价衰老的临床化学指标之一。SOD是体内重要的抗氧化酶，其作用是氧自由基清除剂，是机体老化状态的客观指标，常用作于评价衰老的生化指标[10]。NO是一种强氧化剂，在衰老过程中发挥着重要的作用[11-12]。基于衰老氧化损伤学说，将SOD与MDA作为衰老的临床化学指标。故进一步测定小鼠血清中MDA、SOD、NO的含量，研究发现模型组与空白对照组相比，模型组小鼠SOD、NO含量降低，MDA含量升高，说明自然老化的模型小鼠可作为理想的测定衰老相关的临床化学指标动物模型。在给予四君子汤进行干预的小鼠血清中，干预组与模型组相比SOD、NO含量升高，MDA含量降低，说明四君子汤能有效调节自然衰老造成的自由基紊乱和组织氧化程度，具有一定的干预衰老作用。

利用代谢组学的研究方法结合UPLC-HDMS技术对相关代谢生物标记物进行分析，通过四君子汤对自然衰老小鼠的内源性代谢物的调节作用进行研究，发现与自然衰老相关的主要代谢生物标记物。

亮氨酸是最有效的一种支链氨基酸，其主要作用是修复肌肉和控制血糖，同时为给机体提供能量。亮氨酸能够有效保持肌肉功能、防止肌肉流失。研究表明老年人血浆中的氨基酸含量明显降低，支链氨基酸含量降低尤为显著。本研究中模型组亮氨酸较空白组含量极显著性降低，推测在衰老模型中给身体组织提供能量作用减弱。

血栓素是一种类花生酸类物质，能够拮抗前列环素，具有血小板凝聚和血管收缩作用的主要血管活性物质。研究显示[14]随着年龄的增加老化血管TP受体对血栓素的敏感性增强，血栓素发生相应改变。在本次实验中发现模型组血栓素含量值较空白组极显著性升高，表明小鼠体内花生四烯酸代谢发生混乱，推测随着小鼠的自然衰老，从而逐渐产生衰老性内皮功能障碍，而四君子汤能够调节血栓素含量，从而对衰老性内皮功能障碍具有调节作用。

花生四烯酸是人体重要的不饱和脂肪酸，在机体血液、肝脏、肌肉等系统中起重要作用。花生四烯酸对人体大脑智力发育和视敏度有着重要的作用，还能够调节血细胞功能，对人体心血管系统及免疫系统具有十分重要的作用。多不饱和脂肪酸在神经系统的发育和维持大脑正常功能方面都起着十分关键的作用，是衰老过程的重要物质。研究发现[15]老年痴呆病患者机体内花生四烯酸的含量降低。在本实验中对模型组小鼠的血液进行检测发现花生四烯酸的含量降低，表明其神经系统发育合免疫系统受到抑制。

谷胱甘肽是人体必不可少的抗氧化剂，具有抗氧化和整合解毒作用。人体肝脏的谷胱甘肽能将机体的有害物质排泄出体外，能帮助人体保持正常的免疫功能。谷胱甘肽在人体内的生化防御作用是清除人体内新陈代谢产生的自由基，保护过多自由基会损伤的生物膜以及蛋白质和酶等分子中的巯基。

将得到的7个具有调整作用的生物标志物进行MetPA分析，经分析发现这7个标志物主要参与3条代谢通路，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和氨酰tRNA生物合成。这些代谢通路在自然衰老小鼠体内发生紊乱，而给予四君子汤后可使之逆转并向正常状态转归，从代谢组学视角揭示了四君子汤对衰老的调节的整体性过程。该研究表明氨基酸代谢在衰老过程中扮演了重要角色，并且过氧化损伤及自由基代谢失衡是衰老的重要表征，四君子汤作为经典补益方剂[16-17]，经代谢组学研究发现四君子汤能够改善衰老造成的氨基酸代谢紊乱，同时对自然衰老所造成的自由基代谢紊乱具有回调作用。

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Metabolism of Intervening Effect of Sijunzi Decoction on the Natural Aging Mice

SUI Yu-tong1，LI Ze-guang2,ZHU Ming-xue1，LAN Xin-jian1，YAN Qi1，LIANG Hua1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To study the changes of endogenous metabolites in natural aging mice by Sijunzi decoction, and to explore the metabolism, metabolic pathway and the regulative effect of Sijunzi decoction. Methods: Select natural aging mice and detect their serum SOD, MDA and NO; the serums of natural aging mice were identified by UPLC-HDMS technology. Results: The contents of SOD and NO in the model group were significantly decreased and MDA was increased; the contents of SOD in serums were significantly increased and MDA was significantly decreased by Sijunzi decoction. Identify 25 biomarkers and 3 metabolic pathways that might be associated with aging. Sijunzi decoction on some markers such as leucine, thromboxane, arachidonic acid and glutathione had an obviously callback effect. Conclusion: Through the research methods of metabolomics,Sijunzi decoction by regulating the leucine, thromboxane, arachidonic acid, glutathione and other markers of senescence has an interveningeffect.

Aging; Metabolomics; Sijunzi decoction

2016-07-08

2016-09-15

国家自然科学基金项目(81473563)

隋雨桐(1988-)，男，博士研究生，研究方向:衰老及代谢相关疾病的方剂配伍规律。

*通讯作者：梁华(1962-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:衰老及营养代谢相关病症的方剂配伍规律。

R289;R285.5

A

1002-2392(2017)01-0016-05