伍佰鑫 张翠永 李 晟 罗 阳 浣 成 樊志坚

(湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131)

一般来说，反刍动物可将20%～30%日粮中的氮转化为机体蛋白，大约70%～80%的氮以尿和粪的形态排泄掉。蛋白质是一种昂贵的养分，受经济和环境的影响。此外，过量的氮排泄到大气、土壤和地下水中，对环境有害。肉牛生产者为了让肉牛快长和增膘，经常饲喂较多的精饲料，特别是在日粮中添加大量的豆饼、花生饼、大豆等优质蛋白质饲料，不仅造成饲料浪费、增加饲料成本，而且给肉牛胃肠增加负担，甚至引起疾病。但如果添加少了，就不能满足肉牛生长对蛋白质的需要，影响育肥效果和经济效益。肉牛饲料中蛋白质含量多少为适宜，已成为肉牛生产面临的现实问题。最近，美国内华达州大学的Paloma de Melo Amaral和巴西维科沙大学的Lays Débora Silva Mariz等学者运用先进的连续培养系统、用发酵罐模拟瘤胃，对肉牛10%～14%蛋白质含量的日粮进行了研究，其研究方法和结果值得肉牛生产者和研究者参考。

1 材料和方法

在连续4个阶段、每个阶段持续12 d(其中8 d为日粮适应期、4 d为样本采集期)，使用8个双流量连续培养发酵罐(1223±21 mL)。采用4×4拉丁方设计、4个处理和4个阶段，每个处理总共8个重复。日粮处理包括：①静态的10%粗蛋白日粮(简称10%CP)、②静态的12%CP日粮(简称12%CP)、③静态的14%CP日粮(简称14%CP)、④每48小时在10%CP和14%CP之间振荡的日粮(简称10%～14%振荡)。日粮(干物质)由50%的果园干草和50%的精饲料组成，日粮的配方和营养组成(根据NRC标准)详见表1。

2头接有瘤胃瘘管的安格斯肉牛(平均体重785 kg)，早晨饲喂前2 h，从瘤胃的腹部、中部和背部区域收集瘤胃液，立即通过四层纱布过滤，将过滤后大约10 L的瘤胃液转移到实验室事先预热的保温瓶(39 ±0.5℃)中。瘤胃液均质化后，注入氮气(N2)以维持厌氧环境，将事先水浴预热的5 000 mL锥形烧瓶淹没其中，并将温度调整到39。每个发酵罐倒入大约1 250 mL的瘤胃液，直至溢出物被清除干净(图1)。维持温度为39°C并将氮气(40 mL/min)注入发酵罐以维持厌氧环境。添加尿素到人工唾液中以模拟氮回收。每个发酵罐用单个的pH计(Cole-Parmer pH controllers，Model 5997-20)监控pH值。中间由磁铁驱动的螺旋桨以150 rpm的速率不断搅拌发酵罐的内容物。通过调整人工唾液灌注和过滤液流，将固体和液体的稀释率分别调整为5.5和11%/h。以2.1 mL/min的速率不断灌注人工唾液，每天2次测定其连贯性。

表1 试验日粮的原料和化学组成

备注：CP-粗蛋白质、DM-干物质、OM-有机物、NDF中性洗涤纤维、EE-乙醚提取物(粗脂肪)、ME-代谢能；矿物质盐(1 kg DM)包含：氯化钠100 g、锌12.5 g、铁12.5 g、锰12.5 g、铜1 750 ppm、碘450 ppm、钴240 ppm。

图1 双流量连续培养系统

每个发酵罐每天投入72 g(DM)的日粮，分2次(上午9点和晚上9点)等量投入，即每次36 g。食糜固体和液体分开收集在4 L的塑料桶中。在日粮适应期的每天上午8:30，给塑料桶称重并移除内容物。在试验的8～12 d，每个塑料桶注入20mL浓度为50%的硫酸，并将塑料桶(大约三分之二的深度)浸入4℃水浴中，以防止微生物和酶的活动。在每个试验期的第9、10、11、12 d，将每个发酵罐的液体和固体溢出物用搅拌器混合并均质化，通过真空系统收集500 mL样本并-20°C保存。每个试验期发酵罐的溢出物有2 000 mL，另外收集300 mL冻干并用研钵弄碎作为子样本，放入另外的塑料容器作进一步的化学分析。剩余的发酵罐溢出物用两层纱布过滤，取2个10 mL，分别添加0.2 mL浓度为50%的硫酸溶液、保存，留待以后分析氨态氮(NH3-N)和挥发性脂肪酸(VFA)。

在试验的第7 d，发酵罐开始灌注15氮[硫酸铵15(NH4)2SO4]之前，收集每个发酵罐的污水样本(固体和液体)，用于测定背景15氮的丰裕度。然后，将富含10% 15氮原子的0.077 g硫酸铵灌注到每个发酵罐，用于瞬时标记氨氮(NH3-N)池。添加0.077 g/L的15(NH4)2SO4，替代等氮量的尿素，以便发酵罐中15氮的浓度维持稳定状态。

在试验的第10 d和第12 d，在发酵罐投入日粮之后的0、1、2、4、6、8、10 h，用手提式pH计测定每个发酵罐(模拟瘤胃)的pH值。在每个试验期的最后一天，整个发酵罐的内容物用两层纱布过滤，液体在4℃时离心(1 000 g)10 min、移除饲料颗粒。然后，将悬浮液离心(10 000 g)20 min，去掉悬浮液，将细菌颗粒冻干和保存以便进一步分析。

日粮和食糜样本根据AOAC分析DM(干物质)、粗蛋白(CP)和乙醚浸出物(EE粗脂肪)。有机物(OM)根据DM和灰分的差值计算。NDF(中性洗涤纤维)和ADF(酸性洗涤纤维)根据Van Soest方法，用不含亚硫酸钠的α热稳定淀粉酶处理，依次用纤维分析仪(Ankom200)分析。微生物颗粒和食糜污水按日粮分析法测定DM、CP和灰分。食糜污水中挥发性脂肪酸的浓度用气相色谱分析。氨氮浓度用色度比色分析。

2 试验结果

与第2组(静态的12%粗蛋白日粮)相比，瘤胃(发酵罐)对DM(干物质)、OM(有机物)、NDF(中性洗涤纤维)和ADF(酸性洗涤纤维)的表观消化率，既不受日粮粗蛋白增加也不受日粮粗蛋白振荡的影响(P>0.05)。瘤胃(发酵罐)对DM和OM的真实消化率在各处理组之间同样也无差异(P>0.05)。详见表2。

表2 双流量连续培养系统中瘤胃的消化率

表3 双流量连续培养系统中瘤胃的pH和VFA

表4 双流量连续培养系统中瘤胃的氮参数

备注：微生物效率 = 微生物氮(g)÷ 真实消化的干物质(kg)；RDP供应(瘤胃降解蛋白供应)= 总氮流动 - 微生物氮RUP流动(瘤胃非降解蛋白流动)= 摄入的总氮 - 瘤胃降解蛋白流动

随着日粮粗蛋白(CP)水平的增加，瘤胃(发酵罐)内的pH值呈现极显著的(P<0.01)线性正效应(表3)。但是，第4组(每48 h在10%CP和14%CP之间振荡的日粮)与第2组(静态的12%CP日粮)瘤胃(发酵罐)内的pH值差异不显著(P>0.05)。日粮与时间的交互作用不显著(P>0.05)。总的VFA(挥发性脂肪酸)浓度和单个VFA摩尔比例(醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸)，不受日粮粗蛋白水平或日粮CP振荡的影响(P>0.05)。

随着日粮CP水平的增加，瘤胃(发酵罐)内的氨氮(NH3-N)浓度(表4)呈现显著的二次效应(P<0.05)。14%组瘤胃(发酵罐)内食糜污水的氨氮(NH3-N)浓度大约比10%组和12%组大3倍。各处理组之间的总氮(N)、非氨氮(NAN)和瘤胃非降解蛋白(RUP)的流动以及CP可消化性都无差异。10%～14%振荡组与12%组比较时，微生物氮和氨氮的流动、微生物效率差异都不显著(P>0.05)，但当日粮CP水平增加时，这些变数呈现显著的(P<0.05)二次效应。

2 结论

与静态的12%CP肉牛日粮相比，每间隔48 h、10% CP和14% CP之间振荡的日粮对瘤胃氮代谢和微生物效率无影响，表明每间隔48 h、10%CP和14%CP之间振荡的日粮不会改善肉牛瘤胃养分的消化性、瘤胃发酵、瘤胃氮代谢和微生物效率。暗示瘤胃微生物对振荡的CP水平不响应，或者能够积极应对48 h期间的营养不良。12% CP的日粮对瘤胃微生物氮的流动和微生物效率产生正面影响，因此，这是改善瘤胃氮利用的最佳方案，超过这一水平(12% CP)，日粮中增加再多的CP含量也没有进一步的好处。

[1] Paloma de Melo Amaral, Lays Débora Silva Mariz. Effects of Static or Oscillating Dietary Crude Protein Levels on Fermentation Dynamics of Beef Cattle Diets Using a Dual-Flow Continuous Culture System[J].PLoS One. 2016,11(12): e0169170.

中国牛业科学2017,43(5):25-27ChinaCattleScience科学实验