姚一博，贾 媛，夏小婷，祝远魁，蓝贤勇，黄永震，陈 宏，雷初朝﹡

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 湖南天华实业有限公司，湖南 涟源 417126)

黄牛是我国重要的家畜之一，具有重要的经济文化价值。我国拥有丰富的黄牛品种资源，可以根据体态特征分为低峰、有峰和无峰三种，也可以按照地理分布划分为长珠、黄淮和蒙古三组[1]。20世纪末，我国养牛业飞速发展，引进了大量的外来品种，给地方品种资源带来了极大的冲击，一些品种已经濒临灭绝。因此研究我国地方黄牛品种资源的遗传多样性，对地方品种资源的保护和利用具有重要意义。湘西黄牛主要分布于湖南省的凤凰、桑植、永顺、慈利、花垣等县，具有体质结实，肢蹄强健，耐旱，抗湿及耐粗饲等特点[2]。目前，国内对湘西黄牛这个地方品种的研究较少[3]。

高等动物线粒体DNA(mtDNA)是一个闭合的共价环形双链DNA分子，其遗传方式遵循母系遗传，另外还拥有结构稳定简单、单拷贝、无重组、进化快等特点，其中D-loop区的进化速度较mtDNA其他区域更快，是研究母系遗传的最好的标记之一[4]。Lei等[5]分析了中国28个黄牛地方品种的mtDNAD-loop序列，发现在不同黄牛品种间mtDNA的遗传多样性非常丰富，并揭示了我国黄牛主要为普通牛和瘤牛两大母系起源。Lai等[6]对14个中国地方黄牛品种的mtDNAD-loop序列多态性进行研究，结果表明我国黄牛是瘤牛和普通牛混合起源，且南方和西南方的黄牛受瘤牛的影响更大。本研究测定了33头湘西黄牛的mtDNA D-loop区全序列，以探究湘西黄牛的遗传多样性，为湘西黄牛的遗传资源保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在湖南省花垣县采集33头湘西黄牛血液样本，带回实验室于-20℃冰箱保存备用。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增测序

利用酚-氯仿法提取黄牛基因组DNA。黄牛mtDNA D-loop全序列采用雷初朝等[7]设计的引物，正链序列为：5′- CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′；反链序列为: 5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反应体系为20 μL，扩增条件：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，40个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用1.0%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，将符合测序要求的PCR产物送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。

1.3 数据处理与统计分析方法

利用DNASTAR中的SeqMan程序进行同源序列比对，并进行人工校正，以确保所测序列的可靠性。用DNASP 5.0统计核苷酸多态位点、单倍型数量、单倍型多样度、核苷酸多样度、平均核苷酸差异等。用MEGA5.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 湘西黄牛mtDNA D-loop区核苷酸变异与单倍型多样度

对33头湘西黄牛mtDNA D-loop区全序列长度进行分析，结果表明1头黄牛 D-loop区长度为909 bp，11头黄牛 D-loop区长度为910 bp，17头黄牛D-loop区长度为911 bp，4头黄牛D-loop区长度为912 bp，D-loop区长度的变异是由D-loop区存在碱基的插入与缺失引起的。共检测到D-loop区全序列的变异位点55个，占核苷酸总数的6.04%，其中转换53个(包括33个C/T转换，20个A/G转换)，约占核苷酸多态位点的96.4%；1个C/G颠换，约占核苷酸多态位点的1.8%；1个转换与颠换共存位点(C/G+A/G), 约占核苷酸多态位点的1.8%。T、C、A、G的含量分别为28.1%、25.3%、33.2%、13.4%，C+G平均含量为38.7%。利用DNASP 5.0软件比对分析33头湘西黄牛mtDNA D-loop序列，共发现15种单倍型(图1)，其中2个属于普通牛单倍型，13个属于瘤牛单倍型。在这15个单倍型中，每个单倍型包含的个体数如图1所示。平均核苷酸差异(k)为13.1099，单倍型多样度(Hd)为0.8750±0.0470，核苷酸多样度(Pi)为0.0144±0.0042。

图1 湘西黄牛15个mtDNA D-loop单倍型及其多态位点

图2 湘西黄牛15个mtDNA D-loop单倍型构建的NJ系统发育树

2.2 湘西黄牛系统发育树的构建

为了研究各单倍型间的系统发生关系，根据GenBank发布的欧洲普通牛(No.V00654)和印度瘤牛(No.L27733)作为参考序列，用MEGA5.0软件对湘西黄牛的15个单倍型构建系统发育树(图2)。结果显示湘西黄牛明显分为普通牛和瘤牛两大分支，说明湘西黄牛是普通牛和瘤牛的混合母系起源。

3 讨论

目前国内关于地方黄牛品种mtDNA D-loop区序列的核苷酸多样性的研究较多[1, 3, 5-16]，但是对于湘西黄牛的mtDNA D-loop区序列的核苷酸变异分析的报道较少。周艳等[3]分析了4头湘西黄牛mtDNA D-loop区序列多态性，发现其Hd值为0.500，Pi值为0.0006。由于本研究的样本量是其八倍，所以结果能更准确地反映湘西黄牛mtDNA的遗传多样性。本研究选择了33个湘西黄牛个体，对其mtDNA D-loop区进行扩增，测序并分析。共发现55个核苷酸突变位点，其中53个转换、1个颠换、1个转换与颠换共存位点；碱基T、C、A、G的平均百分比分别为28.1%、25.3%、33.2%和13.4%，表明湘西黄牛富含A、T碱基。

单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)是衡量群体遗传变异的重要指标。Jia等[8]分析了13个中国地方黄牛品种125个个体和2个德国黄牛个体的mtDNAD-loop区的全序列遗传多态性，发现其Hd值为0.8880，Pi值为0.0251；张桂香等[13]通过对我国16个黄牛品种共206个个体的线粒体D-loop区序列多态性进行研究，结果表明其Hd值为0.9320，Pi值为0.0227。而本研究表明湘西黄牛的Hd值为0.8750，Pi值为0.0144，与Jia等[8]和张桂香等[13]的研究结果相比要低一点，说明湘西黄牛的mtDNA的遗传多样性较低，这可能是由“创立者效应”造成的[3]，也可能与湘西黄牛产区山高坡陡石头多，环境相对封闭，没有大量引进周围湘西黄牛的条件有关[17]。在33个湘西黄牛个体中，5个普通牛起源的个体(占15.15%)共享2个单倍型，28个瘤牛起源的个体(占84.85%)共享13个单倍型，说明湘西黄牛受瘤牛的影响更大。本研究与周艳等[3]对部分中国南方黄牛mtDNA D-loop区的研究结果吻合。

总之，本研究发现湘西黄牛mtDNA遗传多样性比较低，具有瘤牛和普通牛两大母系起源，但受瘤牛影响更大。由于湘西黄牛的遗传多样性较低，在自然选择的条件下容易近亲繁殖，故应加强对该品种资源的保护和利用。

[1] 陈幼春, 曹红鹤. 中国黄牛品种多样性及其保护 [J]. 生物多样性, 2001, 9(3): 275-283.

[2] 国家畜禽遗传资源委员会. 中国畜禽遗传资源志-牛志 [M].北京:中国农业出版社, 2011.

[3] 周艳, 陈宏, 贾善刚, 等. 中国南方部分黄牛品种mtDNA D-loop区的遗传变异与分类分析 [J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008, 36(5)：7-11.

[4] Pfeiffer I, Voelkel I, Brenig B. Phylogenetics of the European Dahomey miniature cattle based on mitochondrial D-loop region DNA sequence [J]. Animal Genetics, 2015, 36(2): 179-181.

[5] Lei C Z, Chen H, Zhang H C, et al. Origin and phylogeographical structure of Chinese cattle [J]. Animal Genetics, 2010, 37(6): 579-582.

[6] Lai S J, Liu Y P, Liu Y X, et al. Genetic diversity and origin of Chinese cattle revealed by mtDNA D-loop sequence variation [J]. Molecular Phylogenetics & Evolution, 2006, 38(1): 146-154.

[7] 雷初朝, 陈宏, 杨公社，等. 中国部分黄牛品种mtDNA遗传多态性研究 [J]. 遗传学报，2004, 31(1): 57-62.

[8] Jia S, Chen H, Zhang G, et al. Genetic variation of mitochondrial D-loop region and evolution analysis in some Chinese cattle breeds [J]. Journal of Genetics and Genomics, 2007, 34(6): 510-518.

[9] 蔡欣, 陈宏, 雷初朝, 等. 中国17个黄牛品种mtDNA变异特征与多态性分析 [J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2007, 23(8): 666-674.

[10] 房兴堂, 周艳, 陈宏, 等. 中国黄牛mtDNA D-loop遗传多样性及起源 [J]. 动物学报，2007, 53(5): 928-933.

[11] 赖松家, 刘延鑫, 李学伟, 等. 四川黄牛品种线粒体DNA遗传多样性研究 [J]. 畜牧兽医学报, 2005, 36(9): 887-892.

[12] 刘若余, 夏先林, 雷初朝, 等. 贵州黄牛mtDNA D-loop遗传多样性研究[J]. 遗传, 2006, 28(3): 279-284.

[13] 张桂香, 郑友民, 王志刚, 等. 我国部分黄牛品种线粒体D-loop区遗传多样性与起源分化 [J]. 遗传, 2009, 31(2): 160-168.

[14] 孙婷, 党瑞华, 黄永震, 等. 黄陂牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究 [J]. 中国牛业科学, 2017, 43(3): 1-3.

[15] 夏小婷, 贾媛, 赵明, 等. 夷陵黄牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究 [J]. 中国牛业科学, 2017, 43(1): 4-7.

[16] 赵晓诚, 党瑞华, 黄永震, 等. 岭南牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究 [J]. 中国牛业科学, 2017, 43(2): 1-3.

[17] 李瑞武, 陈功建, 罗振. 湘西黄牛的品种特征与生存环境分析 [J]. 中国牛业科学, 2005, 31(6): 69-70.