赵云雷，王红梅，陈伟，龚海燕，桑晓慧，崔艳利，赵佩

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

基于优异等位基因的棉花抗黄萎病性状的分子鉴定

赵云雷，王红梅，陈伟，龚海燕，桑晓慧，崔艳利，赵佩

（中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

【目的】发掘棉花抗黄萎病相关的优异等位基因，利用优异等位基因对棉花抗黄萎病性状进行分子检测，实现对抗病性的快速鉴定和对抗病基因型的直接选择，有效解决当前抗病性鉴定周期长、抗病性选择效率低的技术难题。【方法】选用125份陆地棉优异种质，分别采用田间黄萎病病圃鉴定和温室接种鉴定对材料进行抗黄萎病鉴定，分析材料的抗病性变异；通过筛选前期获得的与棉花抗黄萎病表型显著关联的优异等位基因位点并计算其效应值，分析不同材料中含有的优异等位基因数目及其优异等位基因效应值之和，研究利用优异等位基因位点进行棉花抗黄萎病预测的可行性，并比较基于优异等位基因位点的抗病性分子鉴定与传统抗病性表型鉴定的相关性。【结果】陆地棉在黄萎病抗性方面表现出广泛的变异，125份种质材料在田间病圃鉴定条件下和温室鉴定条件下的抗黄萎病相对病指变化范围分别为10.10—76.6和17.01—72.63；基于前期的研究结果共筛选到40个抗黄萎病优异等位基因，效应值的变化范围为-8.20—-0.39，每份材料含有的优异等位基因数目为1—24个，每份材料中的优异等位基因效应值之和的变化范围为-92.37—-0.86；相关性分析结果表明，每份材料中含有的优异等位基因效应值之和与材料的抗黄萎病相对病指极显著正相关，病圃鉴定与温室鉴定条件下两者的相关系数分别为0.616和0.566；材料的优异等位基因数目与材料的抗黄萎病相对病指极显著负相关，病圃鉴定与温室鉴定条件下两者的相关系数分别为-0.618和-0.535。【结论】棉花种质材料中含有的优异等位基因数目、优异等位基因效应值之和与材料的抗黄萎病相对病指间存在显著相关性，表明抗黄萎病优异等位基因的累加具有明显提高抗病性的作用，材料所含有的优异等位基因数目和优异等位基因效应值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的强弱，从而实现对抗病性的分子鉴定。

棉花；黄萎病；优异等位基因；分子鉴定

0 引言

【研究意义】棉花黄萎病是危害棉花最大的世界性病害之一，被称为棉花的“癌症”。实践证明，防治棉花黄病害最经济、安全、有效的方法就是培育和推广抗病品种[1]。抗病品种的选育已成为目前棉花育种的主要方向。然而，近年来，中国棉花抗黄萎病育种进展缓慢，主要原因是中国现有棉花品种资源的遗传基因狭窄，缺乏高抗黄萎病的棉花资源，与病原菌小种的快速变异不相适应[2-3]。在棉花抗黄萎病性状的筛选上，目前，有多种方法对黄萎病抗性进行鉴定[4]，其中，最常用的鉴定方法是在大田环境条件下利用黄萎病病圃对育种材料进行鉴定。然而，由于大田鉴定条件下存在植株成熟早晚和接种量的差异，以及试验小区的干扰，导致目前棉花育种中对抗黄萎病性状的选择效率十分有限，表现为不同年份、不同棉区筛选的抗黄萎病材料的抗病性表现存在较大差异，难以筛选到真正的抗黄萎病材料。因此，如何克服环境条件对抗病性鉴定的影响，实现对抗病基因型的直接鉴定与选择，对棉花抗黄萎病品种的培育具有重要意义。【前人研究进展】近年来，随着分子标记技术的发展，利用分子标记筛选与目标性状基因紧密连锁的分子标记，可以大大提高性状选择的准确性，并且不受环境因子影响。目前，国内外已经定位的与棉花不同生长阶段的抗黄萎病性状相关的分子标记或 QTL已超过了100个[5-17]，利用这些分子标记进行辅助选择，可以有效地提高性状改良的选育效率，加快育种进程。在棉花抗病基因分子标记辅助选择育种上，王芙蓉等[18]利用与检测到的3个抗黄萎病QTL较紧密连锁的SSR标记对杂交后代辅助鉴定，标记 BNL3590在纯合的父、母本基因型后代中，平均病指无显著差异；而标记NAU751和BNL1395的抗性基因型均能显著增加后代的黄萎病抗性，2个标记的抗性基因型聚合后，后代抗性水平极显著提高。孔祥瑞等[19]将与陆地棉黄萎病抗性相关的18个SSR标记用于大田辅助选择育种，结果表明，18个标记中的 BNL1721、BNL2733和BNL3452标记在有/无标记基因型个体间病指差异显著，且选择效应能够在不同世代间稳定遗传。同时，随着遗传学研究的发展，基于连锁不平衡（LD）的关联分析在植物基因组学研究领域得到了成功的应用[20]，为植物数量性状的研究开辟了新的途径。与QTL作图相比，关联分析有以下优点：以自然群体为材料，无需构建作图群体，因此，可以检测到更多的等位基因变异，从而挖掘到更多的与性状关联的分子标记，为基于分子标记的性状筛选奠定基础。【本研究切入点】由于目前在棉花中，利用分子标记对棉花抗黄萎病性状进行选择大多是对来自抗、感亲本杂交的后代分离群体进行选择，这些分子标记仅仅是作为一种辅助手段，仅能用于区分抗病基因型和感病基因型，无法用于多个材料间抗病性大小的比较。【拟解决的关键问题】本研究在前期对棉花抗黄萎病性状进行关联分析的基础上，进一步发掘与棉花抗黄萎病性状显著关联的优异等位基因位点，研究了利用优异等位基因位点进行棉花抗黄萎病性状预测的可行性，并分析了基于优异等位基因位点的抗病性分子鉴定与传统抗病性表型鉴定的相关性。该研究将为棉花抗黄萎病性状的分子检测及标记辅助选择育种提供重要的信息，有助于实现对抗病性的快速鉴定和对抗病基因型的直接选择，有效解决当前抗病性鉴定周期长、抗病性选择效率低的技术难题。

1 材料与方法

1.1 棉花种质材料

棉花材料为125份陆地棉优异种质，这些材料均来自于笔者早期构建的由158份陆地棉优异种质组成的关联群体[21]，在前期研究基础上，通过排除掉基因型数据或表型鉴定数据存在缺失的部分材料，最终确定了125材料用于本研究，这些材料的名称、编号及系谱来源见电子附表 1。其中，材料的编号与前期研究所用的编号一致。

1.2 抗病性鉴定

对125份材料的抗病性鉴定分别采用人工黄萎病病圃鉴定和温室接种鉴定2种方法，其中，人工黄萎病病圃鉴定采用国家棉花品种区试中抗黄萎病的鉴定方法[22]，温室鉴定采用营养钵底部菌液蘸根法接种鉴定[23]，对鉴定方法的详细描述请参考笔者以前的研究[21]。抗病性鉴定所用的黄萎病病菌均为中等致病力的安阳菌系—VD080，所用的感病对照为冀棉11，采用相对病情指数（relative disease index，RDI）表示各个材料的抗病性强弱，相对病情指数的计算方法参考文献[22]。

1.3 优异等位基因的筛选及其效应值计算

在前期研究中，利用均匀分布于棉花全基因组的212对分子标记对158份陆地棉优异种质进行基因型分析，同时利用人工黄萎病病圃鉴定和温室鉴定2种方法对群体进行抗病表型鉴定，在此基础上对棉花抗黄萎病性状进行了全基因组关联分析研究，获得了40个与抗黄萎病表型显著关联的SSR标记位点[21]。将这些 SSR标记序列与陆地棉基因组序列（测序版本号：BGI_Gossypium_hirsutum_v1.0，https://www. cottongen.org/species/Gossypium_hirsutum/bgi-AD1_ge nome_v1.0）进行BLAST比对，根据最好的比对结果（E值最低）确定SSR标记的物理位置，从而将这些SSR标记位点锚定在陆地棉染色体上。进一步分析了每个标记位点的各个等位基因在关联群体中的分布情况，根据ZHANG等[24]的描述，利用公式ai=∑xij/ni－∑Nk/nk计算等位基因的效应值，其中，ɑi是第i个等位基因的效应值，xij是含有第i个等位基因的第j个材料的表型值，ni是含有第 i个等位基因的材料数目，Nk是所有材料的表型值，nk是所有材料的数目。将效应值最低的等位基因（黄萎病病指最低）确定为该标记位点的优异等位基因。

1.4 基因扩增与检测

利用优异等位基因所对应的引物序列对待测的棉花材料进行PCR扩增，PCR反应体系10 µL，其中，含模板DNA 0.1 µg、10×PCR buffer（含Mg2+）1 µL、dNTP（10 nmol·µL-1）0.2 µL、Tag酶（5 U·µL-1）0.1 µL、上下游引物各1 µM。PCR反应程序为95℃ 3 min；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃5 min。扩增产物用浓度10%的垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束参考张军等[25]的方法银染检测。

1.5 数据分析

根据基因扩增结果，对待测的棉花材料进行分子标记基因型分析，根据基因型分析结果统计每个材料含有的优异等位基因及其数目，根据每个优异等位基因的效应值，计算每份材料含有的所有优异等位基因的效应值之和；利用每份材料含有的优异等位基因的数目及其效应值的和来评价材料的抗病性强弱，实现不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的判断。

2 结果

2.1 棉花优异种质的黄萎病抗性

对125份陆地棉材料进行抗病性鉴定表明，陆地棉在黄萎病抗性上表现出广泛的变异。其中，在田间病圃鉴定条件下，125份种质材料的抗黄萎病相对病指变化范围为 10.10—76.6，平均为37.69；而在温室鉴定条件下，125份种质材料的抗黄萎病相对病指变化范围为17.01—72.63，平均为38.51（图1）。方差分析表明，不同材料的相对病情指数间存在极显著差异（P＜0.001），说明了这125份材料的抗病性变异极为丰富；而基于温室鉴定条件和基于田间病圃鉴定条件的相对病情指数（RDI）间不存在显著差异（P=0.5054），即环境效应不显著，说明了温室鉴定和田间病圃鉴定的一致性。进一步比较发现，在温室鉴定条件下表现为耐病的材料（相对病指在20—35）有56份，在这56份材料中，在田间病圃条件下仍然表现为耐病的有36份，表现为感病的材料（相对病指在大于35）的有19份，表现为抗病的材料（相对病指在小于20）仅有1份；另外，在温室鉴定条件下相对病情指数最高的 7份材料（相对病情指数在 57.23—72.63），在田间病圃鉴定条件下仍然表现为高度感病（相对病指在44.8—66）；然而，温室鉴定为抗病的材料仅有1份（相对病指17.1），该材料在病圃条件下表现为耐病（相对病指29.2）。

2.2 抗黄萎病优异等位基因的效应值

前期研究中，在田间病圃鉴定条件下获得30个与抗黄萎病性状显著关联的SSR标记位点，在温室鉴定条件下获得14个与抗黄萎病性状显著关联的SSR标记位点，同时获得在2个鉴定环境中均存在的抗黄萎病性位点4个。通过统计每个标记位点的各个等位基因在关联群体中的分布情况，利用公式 ai=∑xij/ni－∑Nk/nk计算各个等位基因的效应值，将效应值最低的等位基因（黄萎病病指最低）确定为该标记位点的优异等位基因。40个标记位点共获得了40个优异等位基因，效应值的变化范围为-8.20—-0.39。其中，田间病圃鉴定条件下获得30个优异等位基因，效应值的变化范围为-8.2—-0.86；温室鉴定条件下获得14个优异等位基因，效应值的变化范围为-6.0—-0.39；同时获得在2个鉴定环境中均存在的优异等位基因4个。这些优异等位基因的基因组位置信息及其效应值如表 1所示。

图1 田间病圃鉴定和温室鉴定条件下供试材料病指变化频率分布图Fig. 1 Histogram of relative disease index of tested lines identified in field disease nursery and in greenhouse

2.3 基于优异等位基因的抗病性强弱判断

统计每份材料含有的优异等位基因及其数目, 根据每个优异等位基因的效应值，计算每份材料含有的所有优异等位基因的效应值之和，该效应值之和代表了所有优异等位基因聚合情况下的基因效应。利用40个优异等位基因的分子标记对125份材料进行分析表明，每份材料含有的优异等位基因数目为1—24个，125份材料优异等位基因效应值之和的变化范围为-92.37—-0.86（表2）。其中，编号为191的材料（澳152）含有24个优异等位基因，其优异等位基因效应值之和为-92.37，在病圃条件下鉴定出的黄萎病相对病指为26.9，为耐病材料；编号为287的材料（新研96-48）仅含有1个优异等位基因，其优异等位基因效应值之和为-0.86，在病圃条件下鉴定出的黄萎病相对病指为46.5，为感病材料。在病圃鉴定条件下，优异等位基因效应值之和小于-32.6（平均值）的材料共56个，其中有47份材料（83.9%）的抗黄萎病病指在35以下，其中包括5份病指20以下的抗病材料(表3)，这5份材料的名称分别为M-8124-1159（编号169）、中 Arc-185（编号 185）、GK99-1（编号 243）、鲁458（编号264）和99633（编号317），所含有的优异等位基因数目分别为16、14、12、11和15个，优异等位基因效应值之和分别为-50.27、-42.06、-34.10、-35.63和-52.43，在病圃条件下鉴定出的黄萎病相对病指分别为10.1、19.8、17.3、17.6和14.7 （表2）；优异等位基因效应值之和大于-32.6（平均值）的材料共69份，其中有49份材料（71%）的抗黄萎病病指在35以上（表2），例如，高度感病的5份材料大铃棉（编号67）、常德184（编号5）、邯8944（编号123）、苏联21（编号46）和淮棉4（编号9）中，

优异等位基因数目分别为6、4、7、8和6个，优异等位基因效应值之和分别为-12.69、-7.56、-13.97、-20.54和-12.21，在病圃条件下鉴定出的黄萎病相对病指分别为 76.6、73.3、66、60.4和 59.6。这说明利用优异等位基因的效应值之和可以有效的将抗（耐）病材料（黄萎病指 35以下）与感病材料（黄萎病指35以上）区分开，从而实现比较不同材料抗病性强弱的目的。

表1 优异等位基因的基因组位置信息及其效应值Table 1 Physical position and effective values of elite alleles

表2 125材料的优异等位基因数目、效应值之和及抗黄萎病相对病指Table 2 The number and sum of effective values of elite alleles, and the relative disease index of Verticillium wilt resistance of 125 lines

续表2 Continued table 2

续表2 Continued table 2

为了进一步判断利用优异等位基因进行抗病性强弱分析的可行性，将125份材料的优异等位基因数目、优异等位基因效应值之和与材料的黄萎病相对病指进行相关分析，结果表明，优异等位基因数目、效应值之和与材料的黄萎病相对病指间存在显著的相关性，其中，材料的优异等位基因效应值之和与材料的黄萎病病指间存在极显著的正相关，病圃鉴定与温室鉴定条件下的相关系数分别为0.616和0.566；同时，材料的优异等位基因数目与材料的黄萎病相对病指间存在极显著的负相关，相关系数分别为-0.618和-0.535（表3），说明材料所含有的优异等位基因数目和优异等位基因效应值之和均可以用来判断材料的抗病性。

表3 优异等位基因数目、效应值之和与黄萎病病指的相关分析Table 3 The correlation coefficients of number of elite alleles and sum of effective values of elite alleles with relative disease index of Verticillium wilt resistance

3 讨论

目前，对于棉花黄萎病抗性的鉴定，主要有田间病圃鉴定、营养钵苗期鉴定和黄萎病菌毒素法鉴定[4]。其中，田间病圃鉴定能真实反映鉴定材料抗病性的强弱，是目前最常用的方法，然而该方法存在大田环境下的地力条件难以控制、需要每年补接菌量及鉴定周期长等限制因素；营养钵苗期鉴定通常在温室可控条件下进行，具有快速、准确、易操作等优点，目前被广泛使用。然而，由于黄萎病菌致病力的分化，常常导致不同批次、不同年度间同一品种的病情指数变异较大。近年来，通过设置合适的感病对照品种，利用相对病情指数来划分棉花品种的抗病性证明是一种减少环境变异的有效措施[23,26]。本研究中利用田间病圃鉴定和温室营养钵苗期鉴定研究了125份棉花优异种质的抗病性，田间病圃鉴定反映的是整个生育期的发病情况，而温室营养钵苗期鉴定主要反映苗期的发病情况，我们的结果表明，在对于耐病材料和感病的材料的鉴定方面，温室鉴定和田间病圃鉴定具有一定程度的一致性；尽管对于抗病材料的鉴定，由于主效抗病基因的表达具有时空性，导致少部分在温室条件下鉴定为抗病的材料在病圃鉴定条件下表现为耐病，或者反之，然而通过方差分析表明不同鉴定条件下获得的相对病情指数间不存在显著差异，即环境效应不显著，进一步说明了使用相对抗性指数进行抗病性鉴定可消除许多不确定因素对鉴定结果的影响。

目前，国内外学者通过构建双亲间抗病性存在显著差异的遗传分离群体，所定位的与棉花不同生长阶段的抗黄萎病性状相关的分子标记或 QTL已超过了100个[5-17]，这些分子标记或QTL为开展标记辅助选择抗病育种奠定了基础。本研究的分子标记是通过对大量抗病性存在显著差异的陆地棉优异种质进行关联分析获得的，通过与上述QTL结果进行比较，发现在本研究所获得的与抗黄萎病性状显著关联的SSR标记位点中，有8个SSR标记位点位于上述抗黄萎病QTL区间内，其中，NAU980-2、NAU5064-2、JESPR0001-1 3个优势等位基因位点（表 1）均位于蒋锋等[15]定位的棉花抗黄萎病 QTL qV-VD8M-D9-1基因组区域内（Dt_chr9染色体的29 224 283—55 190 112 bp）。这些结果证明了本研究与前人研究的一致性。祁伟彦等[3]利用和黄萎病抗性紧密连锁的 SSR 标记对棉花黄萎病抗性进行了辅助筛选，证明了基于人工病圃筛选和分子标记辅助育种相结合是选育棉花抗黄萎病材料可行、高效的育种方法。同上述基于遗传分离群体的分子标记定位相比，本研究检测到了更多的优异种质材料中存在的抗黄萎病优异等位基因变异，有助于实现基于不同优势等位基因的分子标记辅助选择育种。

棉花抗黄萎病鉴定的一个主要限制因素是病原菌小种的易变性导致品种抗病性的变异。培育具有广谱抗病性的品种是克服病原菌小种变异的一种有效手段。而广谱抗病性产生的分子基础是多个抗黄萎病相关基因的累加。本研究发现种质材料中含有的优异等位基因数目与材料的黄萎病相对病指间存在极显著的负相关，说明了抗黄萎病优异等位基因的累加具有明显提高抗病性的作用。

近来，王铭等[27]通过比较多种鉴定棉花抗黄萎病的方法,提出一种使用黄萎病菌毒素进行联合鉴定的方法,以替代传统病圃鉴定法。尽管基于该方法的鉴定结果与田间病圃法鉴定结果的相关系数为 0.94（P＜0.01），但是该方法仍然没有有效克服病原菌小种的易变性对鉴定结果的影响，也没有实现对抗病基因型的直接鉴定。本研究通过将棉花抗黄萎病分子标记进行等位基因分解，将抗病性分子标记转化为优异等位基因，并通过计算优异等位基因的效应值实现了分子标记的数量化，从而将抗病性表型与基因型联系起来。从理论上讲，优异等位基因的效应值在一定程度上反映了基因对表型的贡献，多个优异等位基因的聚合必将对表型产生积极的影响。我们的研究表明，不同材料中含有的优异等位基因数目、优异等位基因效应值之和与材料的黄萎病相对病指间存在显著的相关关系，其中，材料的优异等位基因效应值之和与材料的黄萎病相对病指间存在极显著的正相关，材料的优异等位基因数目与材料的黄萎病相对病指间存在极显著的负相关，在一定程度上证明了多个优异等位基因的聚合有提高材料抗病性的作用，说明材料所含有的优异等位基因数目和优异等位基因效应值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的强弱，从而实现对抗病性的分子鉴定。

研究表明，陆地棉黄萎病抗性属数量性状遗传[28]，因此容易受到环境条件变化的影响。由于田间病圃鉴定反映的是棉花整个生育期的发病情况，而温室营养钵苗期鉴定主要反映苗期的发病情况，再加上抗病相关基因的表达具有时空性，从而导致田间病圃鉴定条件下获得的优异等位基因位点与温室营养钵苗期接种鉴定条件下获得的优异等位基因位点存在差异。尽管如此，本研究中我们同时获得了在田间黄萎病病圃鉴定和温室接种鉴定2个环境中均显著关联的抗黄萎病优异等位基因及其效应值，可以推测，通过采用新的研究方法，发掘大量的多环境稳定的抗黄萎病优势等位基因，建立基于抗病优异等位基因效应值之和为标准的抗黄萎病实时检测技术，可以实现对抗病性的快速鉴定和对抗病基因型的直接选择，有效解决当前抗病性鉴定周期长、抗病性选择效率低的技术难题。

4 结论

棉花种质材料中抗黄萎病优异等位基因的累加具有明显提高抗病性的作用，材料所含有的优异等位基因数目和优异等位基因效应值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的强弱，从而实现对抗病性的分子鉴定。

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（责任编辑 李莉）

Elite Alleles-Based Molecular Detection for Verticillium Wilt Resistance in Cotton

ZHAO YunLei, WANG HongMei, CHEN Wei, GONG HaiYan, SANG XiaoHui, CUI YanLi, ZHAO Pei
(Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan)

【Objective】Detecting Verticillium wilt resistance in cotton by using molecular markers of elite alleles of Verticillium wilt resistance contributes to fast identification of disease resistance and direct selection of disease resistance genotypes, thus resolving the problems of time-consuming and poor efficiency in selection of disease resistance. 【Method】In this study, Verticillium wilt resistance of 125 elite cotton lines was estimated by using a disease nursery and greenhouse screening method, respectively. Elite alleles related to Verticillium wilt resistance were obtained from the earlier publication of the authors and the phenotypic effect of each elite allele was calculated. The number and the sum of effective value of elite alleles in each cotton line were used to study the possibility of elite alleles-based molecular detection for Verticillium wilt resistance. 【Result】Results of the study showed that widespread variation of Verticillium wilt resistance was observed in upland cotton. The range of relative disease index of Verticillium wilt resistance identified in field disease nursery and in greenhouse was 10.10-76.6 and 17.01-72.63, respectively. A total of 40 elitealleles were obtained and the effective values of each allele was in the range of -8.20--0.39. The number of elite alleles in each lines was in the range of 1-24. The sum of effective values of elite alleles in each line were in the range of -92.37--0.86. Correlation analysis showed that the sum of effective values of elite alleles had a significant positive correlation with relative disease index of Verticillium wilt resistance, and the correlation coefficient in field disease nursery and in greenhouse was 0.616 and 0.566, the number of elite alleles in each line had a significant negative correlation with relative disease index of Verticillium wilt resistance, and the correlation coefficient in field disease nursery and in greenhouse was -0.618 and -0.535, respectively. 【Conclusion】It was concluded that there is a significant correlation between the number of elite alleles, the sum of effective value of elite alleles and relative disease index of Verticillium wilt resistance, implying the accumulation of different elite alleles in one line can improve the disease resistance. The sum of effective value of elite alleles and the number of elite alleles in a cotton line can reflect the disease resistance, thus realizing the molecular identification of disease resistance in cotton.

cotton; Verticillium wilt; elite allele; molecular identification

2016-07-01；接受日期：2016-09-29

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（1610162015A02）、国家现代农业产业技术体系（CARS-18-01）

联系方式：赵云雷，E-mail：yunleizhao2002@126.com。通信作者王红梅，E-mail：aywhm@163.com