时红波，时红林，张向颖，陈德喜，段钟平，任 锋

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京市肝病研究所，北京 100069)

论著/其他

细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中的保护作用及机制

时红波，时红林，张向颖，陈德喜，段钟平，任 锋

(首都医科大学附属北京佑安医院，北京市肝病研究所，北京 100069)

目的 利用D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤模型研究细胞自噬在急性肝损伤中的作用及机制。方法 以C57BL/6小鼠为研究对象，腹腔注射D-GalN/LPS建立小鼠急性肝损伤模型。动物实验分组：对照组、D-GalN/LPS组、雷帕霉素+D-GalN/LPS组、三甲基腺嘌呤(3-MA)+D-GalN/LPS组、Atg7 siRNA+D-GalN/LPS组。观察不同分组中小鼠的生存情况，观察肝组织病理变化评价肝损伤情况，全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平，实时荧光定量PCR检测肝组织中TNFα和IL-6基因表达，荧光显微镜观察肝组织中肝细胞凋亡情况。多样本组间比较采用One-way ANOVA分析，进一步两两比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Games-Howell法。结果 与D-GalN/LPS组相比，应用自噬激活剂雷帕霉素干预后，小鼠生存率明显升高(80% vs 40%)，肝脏出血、炎症和坏死明显减轻，肝细胞凋亡明显减少，血清ALT、AST水平明显降低[ALT：(427.4±195.5) U/L vs (977.7±247.3) U/L，P=0.002；AST：(378.2±169.7) U/L vs (1100.0±438.0) U/L，P=0.004]，肝组织中炎症因子TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显降低[TNFα mRNA：0.288±0.010 vs 1.136±0.267，P=0.003；IL-6 mRNA：0.272±0.061 vs 0.869±0.317，P=0.010]；应用自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA干预后，小鼠生存率明显降低(0、10% vs 40%)，肝脏出血、炎症和坏死明显加重，肝细胞凋亡明显增多，血清ALT、AST水平明显升高[ALT：(1836.0±560.5)、(1654.0±627.6) U/L vs (977.7±247.3) U/L，P值分别为0.006、0.034；AST：(1948.0±645.5)、(1804.0±492.6) U/L vs (1100.0±438.0) U/L，P值分别为0.029、0.033]，肝组织中TNFα表达水平明显升高[2.026±0.342、1.994±0.286 vs 1.136±0.267，P值分别为0.006、0.005]。结论 在D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中，细胞自噬发挥着重要的保护性作用，其调控机制可能与自噬抑制炎症因子和肝细胞凋亡有关。

自噬； 肝功能衰竭,急性； 己糖胺酶类； 脂多糖类； 小鼠,近交C57BL

急性肝损伤是指各种原因引起的肝功能异常，其诱发因素很多，主要有病毒感染、用药不当、乙醇摄入过多、接触或食入有毒食物、外伤以及放射性损伤等[1-2]。肝损伤是急性肝衰竭的基础，严重或持续的肝损伤将最终导致肝衰竭，因此早期干预尤为重要[3]。笔者[4]前期研究发现，在D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)诱导的急性肝损伤早中期，自噬表达逐渐增强，而进展至肝衰竭后自噬表达下降。Wang等[5]研究发现在D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤中，自噬表达亦增高，但在该模型中自噬作用及功能尚不明确。因此，本研究通过探讨自噬在D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤中的作用及机制，以期为急性肝损伤的致病机制及治疗方法提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 由首都医科大学实验动物研究室提供8～12周健康雄性C57BL/6小鼠，置于首都医科大学附属北京佑安医院动物中心饲养，自由进食及饮水，在无任何病原体的条件下饲养1周后进行实验。D-GalN、LPS、雷帕霉素、三甲基腺嘌呤(3-MA)购自Sigma公司。自噬相关蛋白轻链3(light chain 3，LC3)抗体(一抗)以及辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔抗体(二抗)均购自美国Cell Signaling公司；PVDF膜、蛋白定量及ECL发光试剂盒均购自美国Bio-Rad公司。SuperScript Ⅲ Platinum Two-step 实时荧光定量PCR试剂盒购自Invitrogen公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自Roche公司。Atg7 siRNA购自苏州JIMA公司，序列为5′-GCAUCAUCUUCGAAGUGAATT-3′。

1.2 实验分组 (1)对照组(n=10)：给予与D-GalN/LPS模型组相同剂量的PBS腹腔注射；(2)D-GalN/LPS组(n=10)：通过腹腔注射给予D-GalN 700 mg/kg和LPS 10 μg/kg，在D-GalN/LPS处理前2 h通过尾静脉注射给予二甲基亚砜；(3)雷帕霉素+D-GalN/LPS组(n=10)：在D-GalN/LPS处理前2 h，通过尾静脉注射给予雷帕霉素2 mg/kg；(4)3-MA+D-GalN/LPS组(n=10)：在D-GalN/LPS处理前2 h，通过尾静脉注射给予3-MA 10 mg/kg；(5)Atg7 siRNA+D-GalN/LPS组(n=10)：在D-GalN/LPS处理前48 h，通过尾静脉高压注射给予Atg7 siRNA 3 mg/kg。所有实验组在D-GalN/LPS处理后6 h 处死小鼠(对照组在PBS处理后6 h 处死小鼠)，收集血清和肝组织标本。

1.3 检测指标 (1)生存率观察：按照上述方法分组处理后，每组另取10只小鼠，观察小鼠存活时间。(2)蛋白免疫印迹检测：取100 mg肝组织，加入100 μl预冷的组织裂解液，反复匀浆3次；离心取上清液进行蛋白浓度测定；经SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜上；加入一抗(1∶1000稀释)孵育，TBST漂洗3次；二抗(1∶2000稀释)孵育，TBST漂洗3次后，取等量的ECL发光试剂A液和B液混匀后孵育PVDF膜，压片曝光。(3)病理学检测：常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察肝组织损伤情况。(4)血清学检测：全自动生化分析仪测定小鼠血清中ALT、AST水平。(5)实时荧光定量PCR检测TNFα和IL-6：TRIzol试剂提取肝脏组织总RNA，具体操作按照说明书进行；测定总RNA浓度并配制等量总RNA的溶液；使用SuperScript Ⅲ Platinum Two-step 实时荧光定量PCR试剂盒合成cDNA第一链，随后进行实时荧光定量PCR检测，具体操作按试剂盒说明书进行；以次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶做为内参。(6)凋亡细胞原位末端转移酶标记试验(TUNEL)测定肝细胞凋亡：PBS洗涤2次，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min。配制TUNEL检测液，用PBS洗涤2次。在样品上加50 μl TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 自噬激活和抑制对LC3表达的影响 自噬激活剂雷帕霉素明显促进LC3Ⅱ的表达，提示自噬被激活；自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA明显抑制LC3Ⅱ的表达，提示自噬被抑制(图1)。

图1 自噬激活剂和抑制剂对LC3表达的影响

2.2 自噬对肝损伤小鼠生存率的影响 D-GalN/LPS组小鼠7 h开始死亡，在24 h时生存率只有40%(4/10)；雷帕霉素激活自噬后，小鼠的24 h时生存率达到80%(8/10)；应用自噬抑制剂3-MA或Atg7 siRNA阻断自噬表达后，小鼠的24 h时生存率明显降低，分别为0和10%(1/10)(图2)。

图2 实验组肝损伤小鼠的生存情况

2.3 自噬对肝损伤小鼠肝脏病理的影响 与对照组相比，D-GalN/LPS组小鼠肝脏明显充血，HE染色显示肝组织中有出血、炎性细胞浸润和肝细胞坏死。与D-GalN/LPS组相比，应用雷帕霉素干预后，肝脏充血减轻，HE染色显示肝组织出血减少，炎性细胞浸润和肝细胞坏死也明显减少；应用3-MA或Atg7 siRNA干预后，HE染色显示肝组织出血明显增多，炎性细胞浸润和肝细胞坏死也明显增多(图3)。

2.4 自噬对肝损伤小鼠肝功能的影响 5组间肝功能指标ALT、AST比较，差异有统计学意义(F值分别为17.7、19.3，P值均<0.001)。与对照组相比，D-GalN/LPS组小鼠ALT、AST水平明显升高，差异均有统计学意义(P值均为0.001)。与D-GalN/LPS组相比，雷帕霉素干预组小鼠ALT、AST水平明显降低(P值分别为0.002、0.004)；3-MA和Atg7 siRNA干预组小鼠ALT、AST水平明显升高(3-MA：P值分别为0.006、0.029；Atg7 siRNA：P值分别为0.034、0.033) (表1)。

图3 各组小鼠肝组织形态和病理学结果(HE染色，×200)

组别ALT(U/L)AST(U/L)对照组28.7±5.033.7±6.7D-GalN/LPS组977.7±247.31)1100.0±438.01)雷帕霉素+D-GalN/LPS组427.4±195.53)378.2±169.73)3-MA+D-GalN/LPS组1836.0±560.53)1948.0±645.52)Atg7siRNA+D-GalN/LPS组1654.0±627.62)1804.0±492.62)

注：与对照组比较，1)P<0.01；与D-GalN/LPS组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.5 自噬对肝损伤小鼠TNFα、IL-6表达的影响 5组间炎症因子TNFα和IL-6 mRNA比较，差异有统计学意义(F值分别为61.890、19.630，P值均<0.001)。与对照组相比，D-GalN/LPS组小鼠TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P值均为0.001)。与D-GalN/LPS组相比，雷帕霉素干预组小鼠TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P值分别为0.003、0.010)；3-MA和Atg7 siRNA干预组小鼠TNFα mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P值分别为0.006、0.005)(表2)。

表2 不同组间小鼠肝组织中TNFα、IL-6 mRNA表达的比较

注：与对照组比较，1)P<0.01；与D-GalN/LPS组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.6 自噬对肝损伤小鼠肝细胞凋亡的作用 与对照组相比，D-GalN/LPS组小鼠肝组织中肝细胞凋亡明显增加。与D-GalN/LPS组相比，雷帕霉素干预组小鼠肝细胞凋亡明显减少；3-MA和Atg7 siRNA干预组小鼠肝细胞凋亡明显增加(图4)。

3 讨论

20世纪50年代比利时科学家Christian de Duve通过电镜观察到自噬体结构，并在1963年溶酶体国际会议上首次提出“自噬”的概念[6]。自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的细胞自我降解过程[7-9]。受损或多余的蛋白质和细胞器被双层膜的囊泡包裹形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体降解被包裹的物质，而降解产物被释放到细胞质中重新用于物质合成和能量代谢，使细胞在外界应激因素的作用下能够存活下来，属于细胞在不良应激情况下的自我保护机制[10-12]。

图4 自噬对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的作用(×200)

研究[13-15]表明，细胞自噬在刀豆素A和对乙酰氨基酚两种小鼠肝损伤模型中都表现为增高，但是自噬在上述模型中的作用却不同：在刀豆素A诱导的动物模型中，刀豆素A可能诱导肝细胞和肝脏内皮发生自噬性细胞死亡；在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中，自噬激活显著改善了药物导致的急性肝损伤[16-18]。由此可见，在不同方式诱导的肝损伤动物模型中，自噬的作用是不同的，其具体的调控机制更是值得进一步深入研究[19]。

LC3是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3Ⅰ)会降解一小段多肽，转变为膜型LC3(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反应自噬水平的高低[20]。雷帕霉素、3-MA、Atg7 siRNA经常被用于自噬的激活和抑制[21]，本研究首先证明了自噬激活剂雷帕霉素可以促进LC3Ⅱ的表达，提示自噬被激活；自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA可以抑制LC3Ⅱ的表达，提示自噬被抑制，为后续的研究奠定了基础。

本研究发现在D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中，激活自噬可以明显提高小鼠的存活率，减轻小鼠肝脏的出血、炎症和坏死，改善小鼠的肝功能，提示激活自噬对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护性作用。进一步研究发现，在D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中，激活自噬可以抑制肝组织中炎症因子TNFα和IL-6 mRNA表达水平，并且可以明显减少肝细胞凋亡，提示自噬可能通过抑制炎症因子TNFα、IL-6的表达和肝细胞凋亡发挥保护性作用。Jiao等[22]发现，在D-GalN/LPS诱导的小鼠肝损伤模型中，过氧化物酶体增殖物激活受体α对肝损伤的保护性作用是通过促进自噬实现的，与本研究结果一致。

自噬作为一种重要的分子信号通路日益引起人们的关注，本研究结果表明自噬对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有保护性作用，深入研究自噬在肝损伤中的作用机制必将为肝损伤的致病机制和治疗方法提供新的线索和依据。

[1] KHOURY T,RMEILEH AA,YOSHA L,et al.Drug induced liver injury:review with a focus on genetic factors,tissue diagnosis,and treatment options[J].J Clin Transl Hepatol,2015,3(2):99-108.

[2] OH IS,PARK SH.Immune-mediated liver injury in hepatitis B virus infection[J].Immune Netw,2015,15(4):191-198.

[3] Liver Failure and Artificial Liver Group,Chinese Society of Infectious Diseases,Chinese Medical Association; Severe Liver Diseases and Artificial Liver Group,Chinese Society of Hepatology,Chinese Medical Association.Diagnostic and treatment guidelines for liver failure[J].Chin J Hepatol,2013,21(3):177-183.(in Chinese) 中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组,中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组．肝衰竭诊疗指南(2012年版)[J]．中华肝脏病杂志,2013,21(3)： 177-183．

[4] WEI LL,ZHANG XY,ZHANG L,et al.The expression of autophagy in progression of acute liver failure induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide in mice[J].Chin J Hepatol,24(5):120-125.(in Chinese) 魏琳琳,张向颖,张莉,等.细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭中的表达[J].中华肝脏病杂志,2016,24(5)： 120-125.

[5] WANG K,DAMJANOV I,WAN YJ.The protective role of pregnane X receptor in lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced acute liver injury[J].Lab Invest,2010,90(2):257-265.

[6] BETH L,NOBORU M,HERBERT W.Autophagy in immunity and inflammation[J].Nature,2011,469(7330):323-335.

[7] CHATTERJEE C,SPARKS DL.Hepatic lipase release is inhibited by a purinergic induction of autophagy[J].Cell Physiol Biochem,2014,33(4):883-894.

[8] SCHNEIDER JL,CUERVO AM.Liver autophagy:much more than just taking out the trash[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2014,11(3):187-200.

[9] CUI YL,QI C,WANG CF,et al.Role of autophapy in antigen recognition,processing,and presentation in the body′s immune defense[J].Chin J Immunol,2015,31(11):1565-1568.(in Chinese) 崔玉琳,齐翀,王春凤,等.细胞自噬在机体免疫防御中识别、加工、递呈抗原的作用[J].中国免疫学杂志,2015,31(11):1565-1568.

[10] NOBORU M,BETH L,ANA MC,et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J].Nature,2008,451(7182):1069-1075.

[11] KOMATSU M,KUROKAWA H,WAGURI S,et al.The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1[J].Nature Cell Biol,2010,12(3):213-223.

[12] LEVINE B,KROEMER G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell,2008,132(1):27-42.

[13] CHANG CP,LEI HY.Autophagy induction in T cell-independent acute hepatitis induced by concanavalin A in SCID/NOD mice[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2008,21(4):817-826.

[14] DIAO W,JIN F,WANG B,et al.The protective role of myeloid-derived suppressor cells in concanavalin A-induced hepatic injury[J].Protein Cell,2014,5(9):714-724.

[15] RYU KH,KIM SY,KIM YR,et al.Tonsil-derived mesenchymal stem cells alleviate concanavalin A-induced acute liver injury[J].Exp Cell Res,2014,326(1):143-154.

[16] NI HM,BOCKUS A,BOGGESS N,et al.Activation of autophagy protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity[J].Hepatology,2012,55(1):222-232.

[17] NI HM,WILLIAMS JA,JAESCHKE H,et al.Zonated induction of autophagy and mitochondrial spheroids limits acetaminophen-induced necrosis in the liver[J].Redox Biol,2013,1:427-432.

[18] NI HM,BOGGESS N,McGILL MR,et al.Liver-specific loss of Atg5 causes persistent activation of Nrf2 and protects against acetaminophen-induced liver injury[J].Toxicol Sci,2012,127(2):438-450.

[19] SUN HY,WANG XQ,SHI HB,et al.Ganshuang granules protect mouse liver from chronic injury induced by CCl4via autophagy[J].J Clin Hepatol,2015,31(7):1114-1119.(in Chinese) 孙海青,王小琪,时红波,等.肝爽颗粒对CCl4诱导的慢性肝损伤小鼠模型和肝损伤细胞模型的保护作用[J].临床肝胆病杂志,2015,31(7)： 1114-1119.

[20] TOSHIMA T,SHIRABE K,FUKUHARA T,et al.Suppression of autophagy during liver regeneration impairs energy charge and hepatocyte senescence in Mice[J].Hepatology,2014,60(1):290-300.

[21] REN F,ZHANG L,ZHANG X,et al.Inhibition of glycogen synthase kinase 3β promotes autophagy to protect mice from acute liver failure mediated by peroxisome proliferator-activated receptor α[J].Cell Death Dis,2016,7:e2151.

[22] JIAO M,REN F,ZHOU L,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor α activation attenuates the inflammatory response to protect the liver from acute failure by promoting the autophagy pathway[J].Cell Death Dis,2014,5:e1397.

引证本文：SHI HB,SHI HL,ZHANG XY,et al.Protective effect of autophagy in mice with acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide and related mechanisms[J].J Clin Hepatol,2017,33(2):329-333.(in Chinese)

时红波,时红林,张向颖,等.细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中的保护作用及机制[J].临床肝胆病杂志,2017,33(2):329-333.

(本文编辑：王 莹)

Protective effect of autophagy in mice with acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide and related mechanisms

SHIHongbo,SHIHonglin,ZHANGXiangying,etal.

(BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To investigate the role and mechanism of autophagy in acute liver injury induced by D-galactosamine/lipopolysaccharide (D-GalN/LPS) in mice.Methods C57BL/6 mice were used to establish a mouse model of acute liver injury using intraperitoneally injected D-GalN/LPS.In this animal experiment,the mice were divided into control group,D-GalN/LPS group,rapamycin+D-GalN/LPS group,3-MA+D-GalN/LPS group,and Atg7 siRNA+D-GalN/LPS group.The survival of the mice was observed,and liver pathological changes were observed to analyze liver injury.An automatic biochemical analyzer was used to measure the serum levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST),quantitative real-time PCR was performed to measure the mRNA expression of tumor necrosis factorα (TNFα) and interleukin-6 (IL-6),and a fluorescence microscope was used to observe the apoptosis of hepatocytes.A One-way ANOVA was used for comparison between multiple groups; the least significant differencet-test was used for homogeneity of variance and the Games-Howell method was used for heterogeneity of variance.Results Compared with the D-GalN/LPS group,the rapamycin+D-GalN/LPS group had a significant increase in survival rate (80% vs 40%),significantly reduced liver hemorrhage,inflammation,and necrosis and apoptosis of hepatocytes,and significant reductions in serum levels of ALT (427.4±195.5 U/L vs 977.7±247.3 U/L,P=0.002) and AST (378.2±169.7 U/L vs 1100.0±438.0 U/L,P=0.004),as well as significant reductions in the mRNA expression of TNFα (0.288±0.010 vs 1.136±0.267,P=0.003) and IL-6 (0.272±0.061 vs 0.869±0.317,P=0.010).Compared with the D-GalN/LPS group,the 3-MA+D-GalN/LPS group and Atg7 siRNA+D-GalN/LPS group had significant reductions in survival rate (0%/10% vs 40%),significantly aggravated liver hemorrhage,inflammation,and necrosis and apoptosis of hepatocytes,and significant increases in serum levels of ALT (1836.0±560.5 U/L and 1654.0±627.6 U/L vs 977.7±247.3 U/L,P=0.006 and 0.034) and AST (1948.0±645.5 U/L and 1804.0±492.6 U/L vs 1100.0±438.0 U/L,P=0.029 and 0.033),as well as significant increases in the expression of TNFα in liver tissue (2.026±0.342 and 1.994±0.286 vs 1.136±0.267,P=0.006 and 0.005).Conclusion In the mouse model of acute liver injury induced by D-GalN/LPS,autophagy has an important protective effect,and its regulating mechanism may be associated with the inhibitory effect on inflammatory factors and apoptosis of hepatocytes.

autophagy; liver failure,acute; hexosaminidases; lipopolysaccharides; mice,inbred C57BL

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.02.027

2016-10-17；

2016-11-12。

国家自然科学基金(81300349，81270532)；北京市自然科学基金(7162085，7144216)；北京市科技新星计划(Z131107000413016)；首都临床特色研究(Z161100000516113)；北京市医院管理局临床医学发展专项经费资助(XM201308)；国家临床重点专科建设项目(WJWYA-2014-002)；科研基地建设-重大传染病防治协同创新中心(115215)；北京卫生系统高技术人才培养项目资助(2014-3-090，2013-3-075)；北京市医院管理局登峰计划专项经费资助(DFL20151601)

时红波(1978-)，女，副研究员，副教授，博士，主要从事肝损伤再生相关机制研究。

任锋，电子信箱：renfeng7512@hotmail.com。

R575

A

1001-5256(2017)02-0329-05