蔡尽忠

(福建省厦门华厦学院检验科学与技术系 361021)

20世纪80年代中期，Smith等[1]在丝状噬菌体分子生物学研究的基础上提出了噬菌体展示技术(phage display technique)。1989年，英国Winter研究组和美国Lernard研究组同时创建了噬菌体抗体库技术(phage antibody library technique)。1990年，McCafferty[2]在丝状噬菌体表面成功展示具有抗原结合能力的抗体片段，进一步推动了噬菌体抗体库技术的研究。

噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，利用噬菌体表面展示技术把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体表面，并进一步通过“吸附—洗脱—扩增”方法筛选和富集特异性抗体的技术[3]。这一技术将表型与基因型联系在一起，将抗体识别抗原的能力与噬菌体扩增的能力结合在一起，是一项极为高效的表达、筛选体系，在生物技术领域极具应用前景[4]。本文综述噬菌体抗体库的构建原理、技术过程及应用。

1 噬菌体抗体库的技术原理

噬菌体展示技术是一种基因表达和筛选的技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面[5]。这样，外源蛋白或多肽的基因型与表型统一在同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获得相应的编码基因。

虽有多种外壳蛋白被用于噬菌体展示，但目前文献报道的用于抗体分子展示的主要是PⅢ蛋白和PⅧ蛋白[6]。PⅢ蛋白位于噬菌体颗粒的尾端，含有406个氨基酸残基，由3个结构域组成，每个噬菌体含有3～5个副本。3个结构域由甘氨酸富集的连接肽串联起来，在结构上具有高度易变性和灵活性，故其N端可以插入较大的外源片段而不影响噬菌体的结构和功能，而且融合表达的外源片段还可保持相对独立的结构构象[7]。PⅧ蛋白是噬菌体的主要外壳蛋白，含有32个氨基酸残基，每个噬菌体含有3～5个副本。其C端与噬菌体DNA结合，构成噬菌体包膜的内壁，N端游离在外，可容纳较小的外源片段。

噬菌体展示的抗体是在噬菌体表面表达的抗体分子Fab或ScFv，这种表达是通过Fab或ScFv与载体即噬菌体外壳蛋白(PⅢ或PⅧ蛋白)形成融合蛋白而完成。其特点是噬菌体载体既可以识别相应抗原并与之相结合，又能够感染宿主菌而进行再扩增，实现相应融合蛋白的扩增，再经过“吸附—洗脱—扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。将B细胞全套可变区基因克隆出来，组成噬菌体抗体的群体，就成为了噬菌体抗体库[8]，而建立噬菌体抗体库的全套方法便被称为噬菌体抗体库技术。它的最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出特异性抗体。根据抗体基因的来源和组成不同，噬菌体抗体库可分为天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和转基因鼠抗体库。

噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术的发展：一是简并引物的设计成功及从杂交瘤细胞中扩增出全套抗体可变区基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增技术的创建；二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功；三是噬菌体表面展示技术的建立。

应用噬菌体抗体库技术制备抗体的优势在于：①方法简单快速高效，不经过杂交瘤技术和不需复杂的基因工程技术，制备一株抗体仅需几周时间；②抗体筛选范围广，可对百万至亿万个分子进行选择；③用不同的抗原进行筛选，可同时获得几种不同的抗体。

2 噬菌体抗体库的构建过程

构建噬菌体抗体库主要可以分为以下3个步骤：

2.1 扩增全套抗体基因 获取已经过免疫的人外周血淋巴、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞，从中提取总RNA或基因组DNA。理论上每个静止期B细胞可产生100个拷贝的Ig mRNA，而增殖期的浆细胞可产生300个。因此，免疫接种可明显提高Ig mRNA和编码抗原结合部位V区基因的数量。通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增技术获得建库所需的全套抗体基因[9～12]。

抗体基因扩增的5′端引物的设计通常是根据成熟抗体V区外显子的框架1区(FR1)或前导区的保守序列，而3′端引物的设计则主要依据抗体绞链区(J区)的保守序列。根据已有的抗体库基因序列库(Kabat database， V-base， IMGT等)，设计简并引物。分别对抗体 cDNA或DNA扩增后，将扩增产物予以混合。若制备ScFv抗体基因片段，须设计接头(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的编码寡核苷酸，制备VH-linker-VL基因连接物，进行下一步的基因克隆与表达[13，14]。

2.2 构建合适的噬菌体表面展示载体 噬菌体抗体库技术使用的载体是在已有的噬菌粒基础上改建的。这些载体都具备必需的元件, 包括启动子、大肠杆菌前导序列、核糖体结合部位、供外源基因插入的多克隆位点以及丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因。pcomb3是一个经常用于噬菌体建库的载体，它除了保留原载体中的前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外，还引入来自M13噬菌体LacZ启动子、操纵子及用于控制轻链基因的帽子结合位点等。对其进一步拼接编码M13噬菌体外壳蛋白的gⅢ基因，并在克隆位点上加入来自于pbluescript的填充片段便构成了4029 bp的pcomb3。使用载体构建抗体基因库时，可将获得的全套重链和轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆进载体的相应酶切位点。经过随机重排组合将这些基因插入到噬菌体或噬菌粒表达载体多克隆位点中。经克隆进入载体的重、轻链基因间的配对也存在着很大的随机性，这可以丰富抗体库的内涵，增加抗体库的多样性。

2.3 将抗体基因库转化大肠杆菌备用 在建库过程中由于PCR扩增，半合成寡核苷酸的引入以及多步酶学反应等因素产生的重复克隆、无效克隆及克隆数丢失，使库容量偏小。因此，噬菌体抗体库的大小与大肠杆菌转化率明显相关。通过优化实验条件，提高限制性内切酶的酶切与连接效率；选择合适的载体与目的基因的比例；选用转化效率高的感受态细胞，能提高单次连接和转化的效率。再通过增加连接与转化的次数，就能使400 μL感受态的大肠杆菌经电穿孔转化，至少有108个细胞可被噬菌粒载体转染。这与体内抗体库独特型数目一致。如果噬菌粒在体外包装后则还可以明显增加转染大肠杆菌的数量。因此，电穿孔是一种理想而有效的增加大肠杆菌抗体库数量的手段。

3 噬菌体抗体库的筛选

噬菌体抗体库的筛选包括淘筛和鉴定。淘筛(panning)是指噬菌体抗体库与选择的抗原共同孵育，通过几轮洗脱中断噬菌体-抗原反应(不影响噬菌体的感染能力)，弃去未结合的噬菌体，收集结合的噬菌体。具体的步骤：①噬菌体吸附靶抗原；②反复洗涤去除非特异性结合；③洗脱并收集与抗原结合的噬菌体；④再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。经过一轮这样的“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，可使特异性抗体的噬菌体富集20～1000倍。若每一轮淘筛按50倍的富集率计算，经过4轮淘筛，可使噬菌体抗体的富集率达108以上，筛选出占库容量仅为1/108的噬菌体抗体，噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统，能够方便地对库容量在108以上的抗体进行筛选。这种极强的筛选能力是早期的抗体库技术所望尘莫及的[15～17]。

目前，已经根据筛选的不同要求发展出了多种筛选方法，包括：固相淘筛(将抗原固定于免疫管或制成亲和柱进行免疫淘选)、捕获淘筛(将靶抗原特异的单抗或多抗固定于固相表面，随后加入靶抗原进行淘选)、完整细胞淘筛(用完整细胞对抗体库进行淘选)、组织淘筛和器官淘筛等。这些方法均有成功的报道，为噬菌体抗体的淘筛增添了新的途径。

要获得高亲和力的噬菌体抗体，抗体库的筛选是关键环节。在筛选过程中，噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度和清洗时间三种因素对筛选的效率影响较大。当筛选较小的抗体库(107～108克隆)时，在前几轮采用中等的严紧度有利于避免高亲和力低表达克隆的丢失，而较大的抗体库则可采用较高严紧度以较快地富集亲和性克隆。

4 噬菌体抗体库技术的应用

近年来，噬菌体抗体库已成为基因工程抗体研究的热点之一，并被广泛应用于生命科学的各个领域。利用噬菌体抗体库技术已经获得了大量针对病原微生物的抗体，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、风疹病毒、流感嗜血杆菌、破伤风毒素以及严重急性呼吸综合症(SARS)病毒等[18～21]。这些噬菌体抗体中，许多具有临床诊断和治疗的应用前景。以抗体库技术为工具，了解机体受病原微生物感染时所激发的体液免疫反应格局，为疫苗设计和发病机制的研究提供依据。

来源于病人的噬菌体抗体，在基因结构和生物学性质上真实地反映机体的免疫状态。利用这类单抗可以分析自身抗原的表位结构；以人自身抗体为探针分析自身免疫疾病患者血清中自身抗体的“表位指纹”，有助于了解B细胞表位和疾病表现之间的关系。通过分析自身抗体可变区的编码基因，能够了解此类抗体的基因取用规律。利用肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原筛选噬菌体抗体库，能够得到特异性人单抗。将其接在肿瘤坏死因子和其他淋巴因子上，用于肿瘤的免疫治疗，增强抗肿瘤活性；而将其接上同位素则可用于肿瘤显像分析[22]。

噬菌体抗体库技术与单抗技术相比，其优势在于能够制备人单抗，从而避免了鼠单抗应用于人体时而引发的免疫反应。而且，通过体外亲和力成熟技术和动力学常数筛选技术，能够对有关抗体进行改造，从中得到特异性和动力学特性均较好的抗体。

5 结语

噬菌体抗体库技术是抗体工程发展进程的一个里程碑。经过不断努力，目前噬菌体抗体库技术已经比较成熟，并已经在世界范围内推广和应用，在分子生物学、免疫学和医学等领域产生了广泛的影响。

但是此技术目前还有许多问题尚待解决。例如，如何实现抗体的全分子表达，如何获得库容量大、特异性高、敏感性强的抗体库以及如何提高抗体的产量等。可以相信，随着各种优化方法的建立，噬菌体抗体库技术将为治愈某些严重危害人类健康的疾病带来希望。