李 凡，郎 冰，张 楠，马 骄，张 蕊，丁斐嘉，李云鸿，王 银

·论 著·

苦参碱对神经胶质瘤U87细胞的抗肿瘤作用

李 凡1,2，郎 冰3，张 楠1,2，马 骄1,2，张 蕊1,2，丁斐嘉1,2，李云鸿1,2，王 银1,2

目的 研究苦参碱(MT)致神经胶质瘤U87凋亡的作用及其机制。 方法 培养U87细胞，通过CCK-8细胞增殖实验检测MT对U87细胞增殖的影响并确定最佳用药浓度。实验分为正常对照组(Control)和加药组(MT)，利用Western blot检测2组U87细胞中热休克蛋白60(HSP60)和Caspase-3的表达水平及应用免疫荧光染色技术检测MT对U87细胞凋亡的影响。结果 0.4-0.8μg/μl的MT可以减少U87细胞的增殖，与对照组相比，0.4μg/μl的MT促进了HSP60 和Caspase-3的表达，U87细胞数目明显减少(P<0.05)。结论 MT可能通过提高HSP60的表达促进U87细胞的凋亡。

苦参碱；热休克蛋白60;神经胶质瘤

苦参碱(MT)是在苦参根部发现的生物碱，它们具有各种药理活性，表现出具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗纤维化和心血管保护作用[1]。最近MT被证实具有抑制癌细胞的增殖，加速细胞凋亡，抑制癌转移和侵袭等抗癌潜力，是极有前途的抗肿瘤药物[2]，但是MT抗癌的确切机制尚不清楚。热休克蛋白60(HSP60)主要位于线粒体内，研究报道它在病理条件下具有促进细胞凋亡的作用。在心力衰竭的心肌细胞中HSP60的表达和定位发生了改变，导致心肌细胞的凋亡[3]。本文旨在通过CCK-8细胞增殖实验，并检测HSP60 和凋亡因子Caspase-3来研究MT对神经胶质瘤U87细胞的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料：MT购自Tocris公司；HSP60抗体购自Enzo公司；Caspase-3抗体购自Cell Signaling公司；CCK-8试剂盒购自碧云天公司；全蛋白提取试剂盒购自凯基公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；DMEM培养基和胎牛血清为Hyclone公司产品；DAPI染色液购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 U87细胞的培养：U87细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和1%双抗(P/S)的DEME培养基中培养，在37 ℃、5% CO2和95% O2的孵箱中孵育。

1.2.2 CCK-8试剂盒检测U87细胞的增殖：应用CCK-8试剂盒，按照试剂盒操作步骤；MT用无菌的0.01%的PBS充分溶解，与0.4 μg/μl MT共同孵育24 h，分别测定在0.2～1.0 μg/μl浓度的MT作用下U87细胞的增殖程度。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达：设正常培养液培养的细胞为对照组，含0.4 μg/μl的MT的培养基处理U87细胞为实验组；培养24 h后,用全蛋白提取试剂盒提取各组蛋白，用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS PAGE分离后将蛋白转至PVDF膜上,用含5%脱脂牛奶TBST封闭膜2 h,一抗4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤膜后用二抗室温孵育1 h，ECL试剂显色成像。以GAPDH 作为内参照。

1.2.4 免疫荧光染色技术检测细胞数目：24孔板中加入细胞爬片，正常培养液培养细胞设为对照组(Control)和含有0.4 μg/μl MT的培养基处理U87细胞为实验组(MT)。24 h后用PBS清洗玻片，先用4%多聚甲醛常温固定，然后用含有1% Triton X-100透化处理，用正常羊血清37 ℃封闭60 min。用一抗稀释液(PBST稀释)4 ℃孵育过夜，后用PBS清洗玻片，用耦联有Alexa Fluor 594染料的二抗稀释液(PBST稀释)37 ℃孵育1 h，用PBS清洗玻片，最后用DAPI和Mount封片，共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 CCK-8实验结果：CCK-8试剂盒测试结果显示，0.2 μg/μl的MT处理U87细胞24 h对细胞的增殖没有影响，0.4～0.8 μg/μl的MT可以减少U87细胞的增殖，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1(目录后)。

2.2 Western blot检测蛋白表达结果：Western blot结果表明0.4 μg/μl MT作用24 h，与对照组比较，U87细胞中Caspase-3的表达量显著增加，而且HSP60的表达量也明显增加(均P<0.05)，说明MT促进了神经胶质瘤U87细胞的凋亡，并且此凋亡过程有HSP60的参与，见图2(目录后)。

2.3 免疫荧光染色检测细胞数目结果：免疫荧光染色检测显示，0.4 μg/μl MT(24 h)显著地抑制了U87细胞的生长，细胞数目明显减少(P<0.05)(图3，目录后)，表明MT具有促进U87细胞凋亡的作用。

3 讨论

U87细胞来源于星型细胞瘤，是神经胶质瘤的一种。神经胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，恶性程度高，易复发，预后差，死亡率高，目前也是神经系统疾病治疗的一大难题[4]。对神经胶质瘤的治疗以手术为主，但手术有风险，且不一定能完全避免肿瘤转移，也不一定能彻底清除肿瘤细胞。因此，选择天然活性药物抑制肿瘤细胞生长、促进凋亡成为另一种选择。

苦参碱在抗肿瘤方面具有良好的药理活性。很多研究发现苦参碱对胃癌[5-6]、肝癌[7]、肾癌[8]、骨癌[9]等都有明显的抑制作用，其机制可能通过细胞增殖调控、细胞周期、DNA损伤、癌基因修饰、蛋白质修饰等，但是苦参碱对神经胶质瘤的作用还少有报道，尤其是HSP60在其中的作用尚不明确。

正常生理状态下，HSP60主要位于线粒体内(有70%～80%)，小部分位于胞浆。心肌细胞中的研究显示，当发生炎症反应时，HSP60高度表达并转位到细胞膜上，甚至释放至胞外。胞外的HSP60具有很强的免疫原性，可作为自身抗原与细胞膜上的Toll样受体(TLR)-4结合，激活TLR-4信号通路从而引起机体自身免疫反应，导致细胞凋亡[10-11]。我们以前的实验在小胶质细胞BV2中也证实了这一点[12]，HSP60广泛存在于神经胶质细胞中，但是关于HSP60在神经胶质瘤U87中的作用还未见研究。

本实验中，假设MT是通过上调U87细胞中HSP60的表达而促进肿瘤细胞的凋亡，因此检测了MT处理后细胞中HSP60表达水平及凋亡标志因子Caspase-3水平，研究结果证实了这一假设：CCK-8实验证明U87细胞在0.4～1.0 μg/μl MT作用下细胞增殖受到抑制，同时MT处理后，DAPI染色显示细胞核数目比对照组减少，说明U87细胞数目减少，MT对U87细胞的增殖有抑制作用；Western blot检测蛋白表达结果显示胞内细胞凋亡因子Caspase-3的表达水平升高，说明MT具有促进U87细胞凋亡的作用；而且MT促进了胞内HSP60的表达，说明HSP60可能在MT介导的促进U87细胞凋亡过程中发挥着重要作用，但是其具体机制还有待进一步研究证实。

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The anti-tumor effect of matrine on neuroglioma U87

LIFan1,2,LANGBing3，ZHANGNan1,2，MAJiao1,2，ZHANGRui1,2，DINGFeijia1,2，LIYunhong1,2，WANGYin1,2.

KeyLaboratoryofNingxia,NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:WANGYin，Email：yin-wang@hotmail.com

Objective To investigate the effect of matrine on neuroglioma U87 cells.Methods U87 cells were cultured and the optimum drug concentration of MT was tested by CCK-8 cell activity experiment.The cells were divided into the control and experimental group in which were treated with MT.The expression of HSP60 and Caspase-3 were measured by western blot.The expression of HSP60 and the number of U87 cells were measured by immunofluorescence technique.Results Compared with the control group,the expression of HSP60 and Caspase-3was remarkably promoted by MT (0.4 ug/ul) treated,and decreased the number of U87 cells in experimental group (P<0.05).Conclusion MT may promote the apoptosis of U87 cells through upregulating the expression of HSP60.

Matrine;HSP60；euroglioma

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0001

国家自然科学基金资助项目(81571098，31460257)

1.宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏 银川 750004 2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004 3.宁夏银川市人民医院重症监护室，宁夏 银川 750001

李凡(1990-)，男，在读硕士研究生，主要从事神经生物学研究。

王银，Email：yin-wang@hotmail.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20160615.1440.010.html

R285.5

A

2016-02-22 [责任编辑]王凯荣