闫春宇，胡冰涛，王素英

(天津商业大学 生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室，天津,300134)

常压室温等离子体诱变对螺旋藻中氨基酸成分的影响

闫春宇，胡冰涛，王素英*

(天津商业大学 生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室，天津,300134)

旨在了解常压室温等离子体诱变处理对螺旋藻氨基酸含量及营养价值的影响。以TJF1为出发藻株，多功能等离子体诱变仪对藻株进行诱变处理，日立L-8900氨基酸自动分析仪测定其氨基酸组成和含量，利用模糊识别法和氨基酸比值系数法对突变体与出发藻株的氨基酸营养价值进行评价。结果表明：与出发藻株相比，15个突变株中的17种氨基酸含量均高于出发藻株，总氨基酸含量差异显著；突变株的氨基酸含量分布与出发藻株保持一致；总必需氨基酸与总氨基酸含量比值(E/T)维持在0.43～0.45，没有明显变化；2种营养价值评价结果表明，等离子体诱变没有降低氨基酸营养价值；突变株10的总氨基酸含量最高，比出发藻株高出53.52%，可以作为高产蛋白优势藻株。

螺旋藻；常压室温等离子体诱变；氨基酸；营养评价

螺旋藻[Spirulina(Arthrospira)]是一种多细胞原核蓝藻，主要分布在热带、亚热带地区的淡水或盐碱湖泊[1]。它不仅富含蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸和微量元素，而且氨基酸种类齐全，必需氨基酸组成合理，易被人体吸收利用。此外，有些氨基酸还具有多种药理活性，在调节神经、内分泌、免疫和酶活性等方面发挥作用。因此螺旋藻是世界公认的食药同源功能性食品[2-3]。作为一种新型产业，目前虽有60多个国家养殖螺旋藻，但生产的螺旋藻粉主要作为饲料、饵料应用，缺乏多元化的食用、药用产品。其原因主要是养殖藻种单一，养殖过程中藻种退化现象严重，导致生长快、蛋白质及其他活性物质含量高的藻种匮乏。因此，利用诱变育种及相关技术改良现有螺旋藻品种，选育遗传稳定、单一功能性物质含量丰富且高产的突变体势在必行。

常压室温等离子体(ARTP)诱变技术是利用氦气辉光放电形成的等离子射流中的各种活性粒子作用在微生物体上诱发突变[4]。该技术具有放电均匀稳定，活性粒子浓度高，操作简便，诱变快速，环境友好，安全无辐射，操作可控性强等优点[5-8]，相关研究表明[5,9-10]，ARTP技术可以快速突变细菌、微藻、真菌、酵母等微生物，已成为获得高产突变体的有效方法。如最早在2009年，WANG等应用ARTP对阿维链霉菌进行诱变，成功获得阿维菌素产量提高 21%的突变菌株B1a，并且优势遗传稳定[11]。FANG[12]等在2013年利用ARTP诱变仪对藻株S.platensisFACHB-904诱变处理，同时采用高通量筛选出了生长速率提高10.5%的突变株，并且有2个突变株的含糖量分别提高了40.3%、78%，并且这种优势在不同的培养条件可以稳定保持。

本实验利用多功能等离子体诱变仪对螺旋藻藻株进行诱变，探讨诱变对藻株氨基酸组成及含量的影响，并应用模糊识别法和氨基酸比值系数比较诱变后的藻株与出发藻株的营养价值，旨在获得氨基酸含量高、且组成合理的突变藻株，为螺旋藻养殖提供优质藻种。

1 材料与方法

1.1 诱变处理

以分离自津静公路S110处自然池塘的螺旋藻藻株TJF1为出发藻株，利用多功能等离子体诱变仪对其进行诱变，具体处理见表1。

1.2 螺旋藻培养及干藻粉制备

将诱变处理的藻株接种于AB培养基，在光照强度9 000lx，光暗比(12∶12) h，温度(30/28)℃的条件下培养至对数生长末期，1 500目绢纱过滤收集藻泥，用蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥24 h获得干藻粉，4 ℃贮藏备用。

表1 诱变处理及藻株编号信息

注：TJF1为本实验室从津静S110西自然塘分离纯化出的纯培养藻株。

1.3 氨基酸含量测定

准确称取0.020 0 g样品于水解管中，6 mol/L盐酸水解，参照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》[13]方法利用全自动氨基酸分析仪进行检测。

1.4 氨基酸营养价值评价

1.4.1 模糊识别法

参照兰氏距离法[14]定义待评价物质u与标准蛋白模式a的贴近度U(a，u)，以反映待评价对象的营养价值，贴近度越接近1，表示物质的营养价值越高。贴近度计算公式[15]如下：

(1)

式中:ak为标准蛋白模式的第k种EAA含量，1≤k≤7；uik为第i个评价对象的第k种EAA含量，1≤k≤7。

1.4.2 氨基酸比值系数法[16]

利用WHO/FAO必需氨基酸模式[17]，计算不同藻株必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系数(RC)、比值系数分(SRC)。SRC作为评判物质营养价值的指标，表示物质中蛋白质的相对营养价值，SRC越接近100，说明物质营养价值越高[16,18]。

(2)

(3)

SRC=100-RSD×100

(4)

RSD为RC的相对标准差。

表2 FAO/WHO模式蛋白中各必需氨基酸含量 单位：%

2 结果与分析

2.1 诱变对氨基酸含量的影响

出发藻株及突变体的氨基酸测定结果如表3、表4所示。

表3 16株藻株氨基酸组成和含量 单位：mg/g

表4 16株藻株氨基酸组成和含量

注：*代表药效氨基酸；E代表总必需氨基酸；T代表总氨基酸；同一列肩标不同代表显著性不同，P<0.05。

从测定结果可以看出，除色氨酸在样品前处理过程中被破坏外，各突变藻株中均检测到17种氨基酸，且氨基酸含量明显高于出发藻株，不同处理之间氨基酸总量差异显著，其中突变藻株10的总氨基酸含量最高，达到575.81mg/g，比出发藻株提高53.52%；突变株14的变化最小，氨基酸总量提高31.16%。所有突变株的各种氨基酸的含量分布与出发藻株保持一致，谷氨酸与天门冬氨酸含量最高，所占比例分别为15%～17%，10%～11%；组氨酸与半胱氨酸的含量最低，所占比例为1.6%～1.7%、0.2%～0.3%。对16藻株中的各个氨基酸成分进行单因素方差分析，发现除脯氨酸外，其余氨基酸含量在不同藻株中的差异显著(P<0.05)，对其进行多重比较，结果见表3。

对9种必需氨基酸作变异性分析，变异率见图1。结合表3可以看出，异亮氨酸的变异幅度最大，突变株15的异亮氨酸含量最高，为26.59 mg/g，比原藻株高出75%；苯丙氨酸变异系数为10.48%，突变株10中苯丙氨酸达最高值，由原来的15.86 mg/g提高到26.87 mg/g；其余7种氨基酸变异幅度较小，变异系数在9.25～9.84之间。

图1 9种必需氨基酸变异性Fig.1 The variability of 9 kinds of essential amino acids

突变株的总必需氨基酸(E)与总氨基酸含量(T)见图2。从图2中可以看出，藻株的总必需氨基酸(E)与总氨基酸(T)变化趋势基本一致，E/T值保持在0.43～0.45之间，表明诱变处理对非必需氨基酸的影响不大。

图2 16个藻株总氨基酸(T)与总必需氨基酸(E)含量折线图Fig.2 The line chart of the total amino acids and total essential amino acid content in 16 strains

2.2 诱变对氨基酸营养价值的影响

2.2.1 必需氨基酸的RAA、RC及SRC分析

依据FAO/WHO标准模式谱，计算突变藻株及出发藻株必需氨基酸的RAA，结果见表5。计算RC与SRC值，结果见表6。

由表5可以看出：16个藻株中苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸+酪氨酸(Phe+Tyr)的RAA值>1，表明这4种氨基酸相对过剩；缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)的RAA值<1，低于模式氨基酸规定值。甲硫氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)与异亮氨酸(Ile)的RAA值在0.0.85～1.18之间。

比较9种必需氨基酸的RC值，可以看出诱变使得藻株的第一限制氨基酸有所变化。原藻株的第一限制氨基酸为赖氨酸(Lys)，编号1、2、11、14以及15的诱变藻株的第一限制氨基酸保持不变，其余藻株的第一限制氨基酸变为缬氨酸(Val)。因此在商业化生产中可以根据蛋白质互补原则，考虑不同藻株混合养殖，以提高藻粉的营养价值。

表5 必需氨基酸的RAA值

表6 16株螺旋藻的RC与SRC值

注：﹡代表第一限制氨基酸。

比较诱变藻株与原藻株的比值系数得分(SRC)，所有藻株得分均高于75，出发藻株得分最高为81.71。

2.2.2 与模式氨基酸的贴近度比较

依据模糊识别法提供的计算方式，得出各个藻株中的必需氨基酸与标准FAO/WHO模式的贴近度，结果如表7所示。以FAO/WHO模式，得出突变藻株与原藻株蛋白质中氨基酸营养排序。可以看出，15株诱变藻株，除了藻株5的贴近度为0.93外，其他14个藻株的贴近度均为0.94，通过单因素方差分析发现，各个藻株的贴近度之间没有显著性差异(P<0.05)表明诱变处理对藻株中必需氨基酸组成没有显著性影响。

表7 对于模式氨基酸的贴近度

3 结果与讨论

本研究比较了出发藻株与15株突变体的氨基酸含量，发现突变藻株17种氨基酸含量均高于出发藻株；总氨基酸含量依次比对照高出48%、34%、40%、35%、48%、41%、35%、41%、46%、54%、35%、38%、33%、31%、50%；诱变处理使得9种必需氨基酸含量也显著提高，突变株必需氨基酸与总氨基酸比值(E/T)的均值为44.4%，与出发藻株的E/T(44.4%)保持一致，均符合FAO/WHO规定值，表明本实验进行的诱变处理没有影响藻株营养平衡性。

食物蛋白质中必需氨基酸的组成决定了其营养价值的高低，组成比例越接近人体所需氨基酸比例，越容易使人体吸收，营养价值越高。依据氨基酸平衡理论，通过氨基酸比值系数法与模糊识别法2种方法评价藻株的营养价值，发现诱变不仅提高了突变体各种必须氨基酸的含量，而且保持了螺旋藻氨基酸营养价值较高的特点。

突变藻株10与15的总氨基酸含量变化最大，分别比出发藻株高出54%、50%；必需氨基酸含量为(259.35±0.09)、(255.04±5.62) mg/g；9种药效氨基酸含量分别为364.489、359.449mg/g。比较这2个突变株的氨基酸营养价值，尽管氨基酸比值系数得分(SRC)突变株15为78.68高于突变株10(75.90)，但是与模式氨基酸的贴近度均为0.94，因此可以优先考虑突变株10作为高产蛋白质藻株应用于养殖。

另外与出发藻株相比，突变藻株10的药效氨基酸含量明显提高，如作为营养增补剂，用于配制氨基酸输液、调剂和氨基酸营养食品的主要成份苯丙氨酸的含量提高了69%；可以加速体内脂肪氧化分解[19-21]，已开始作为一种膳食补充剂在临床上辅助减肥的亮氨酸的含量提高了60%；通过参与淋巴细胞内的代谢过程发挥细胞免疫作用，在免疫防御和免疫调节、维持和保护肠道黏膜功能及肿瘤特异性免疫方面发挥重要作用[22]，并能够对晚期实体瘤营养不良患者进行营养支持，有助于增加蛋白质合成，减缓因肿瘤引起的蛋白质消耗[23]的精氨酸的含量提高59%；改善心肌收缩功能，降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用[24]，同时通过参与鸟氨酸循环，促进氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增强肝脏功能，消除疲劳的作用，治疗肝脏病和胆汁分泌障碍[25]的天冬氨酸的含量提高了57%。由此可见突变藻株10可以作为药用螺旋藻产品生产的优质藻株。

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The influence of atmospheric and room temperature plasma mutation on the nutritional value ofSpirulina

YAN Chun-yu, HU Bing-tao ,WANG Su-ying*

(The Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Institute of Biotechnology and Food Science of Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134,China)

The aim was to study the influence of atmospheric and room temperature plasma mutation on amino acid contents and nutritional value ofSpirulina. The original strain (TJF1) was treated by multifunctional plasma mutation system(MPMS) , and the amino acid content and composition of all strains are tested by L-8900 type amino acid analyzer, fuzzy distinguish method and amino acid ratio coefficient method are adopted to evaluate the amino acid nutritional values of the mutant strains and the original strain.The result indicates that the contents of 17 kinds of amino acids in all the mutant strains are higher than the original strain; the difference of total amino acid content between mutated and unmutated strains is significant; the distribution of the amino acid content of the mutant strains remain consistent with the original strain; the ratio of total essential amino acids and total amino acid content is 0.43～0.45,but the difference is not significant; the result of nutrition evaluation showed that atmospheric and room temperature plasma mutation did not reduced amino acid nutritional values; the total amino acid content of mutant strain No.10 is the highest, with 53.52% higher than the original strain. According to the research, the mutant strain No.10 can be used as the protein high-yielding mutant strain.

Spirulina; atmospheric and room temperature plasma(ARTP); amino acid; nutritional evaluation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701011

硕士研究生(王素英教授为通讯作者,E-mail:wsuying@tjcu.edu.cn)。

国家自然科学基金(No. 31270050)；天津市创新团队项目(No.TD12-5049)

2016-01-08，改回日期：2016-05-26