张 蕊，张 静，许保海*，徐延昭

HPLC波长切换法同时测定藤药中5种成分的含量

张 蕊1，张 静1，许保海1*，徐延昭2

目的 建立同时测定藤药中5种成分含量的HPLC方法。方法 采用Phenomene C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相采用甲醇(A)-水(B)梯度洗脱：0～15 min (45.0%A)，15～27 min (45.0%→56.0%A)，27～42 min (56.0%→70.0%A)，42～50 min (70.0%→45.0%A)。流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长：0～15 min (248 nm，α-玉柏碱)，15～50 min (254 nm，升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷)。结果 测得α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的平均加样回收率及对应的RSD分别为98.63% (1.60%)、97.82% (1.45%)、99.18% (1.48%)、97.18% (1.29%)和98.19% (1.80%)，且在5.15～103.00、8.13～162.60、4.74～94.80、4.09～81.80、4.35～87.00 μg/mL内，线性关系良好(r≥0.999 1)。结论 采用HPLC波长切换法能有效分析藤药中的5个成分，方法准确可靠，重复性良好，结果稳定，可以作为藤药产品质量控制的方法。

藤药；α-玉柏碱；升麻素苷；升麻素；5-O-甲基维斯阿米醇苷；亥茅酚苷

0 引言

藤药是我院(北京积水潭医院)协定处方制剂，是我院60年代中医科主任佟阔泉主任医师(清末御医)的经验方，由伸筋草、防风、透骨草、海桐皮、木瓜、地枫、独活、赤芍、红花、骨碎补、急性子、川椒、乳香、白芷、川牛膝、桂枝、大青盐17味中药材加工而成的医院院内制剂，具有舒筋活血、疏风定痛、消肿散结的功效，对风寒痹痛湿痹、腰腿诸痛、风寒入筋络等症状的治疗效果显著。现标准仅对该制剂的性状及生产过程进行了控制，未对该制剂中任何药味进行定量控制研究，方中伸筋草祛风散寒、除湿消肿、舒筋活络，为方中君药，其主要成分是α-玉柏碱；方中防风祛风解表、胜湿止痛、止痉定搐，为方中臣药，其主要成分是升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷。为了确保藤药临床用药的安全有效和质量一致性，本文建立了简便、可靠、准确度高的 HPLC方法，对藤药中的α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量进行了定量测定。样品处理方法简便，测定结果准确，适用于藤药质量标准的提高。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP1100型高效液相色谱仪(美国Waters)，Agilent1100型紫外检测器(安捷伦科技有限公司)；XS105 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试药 藤药(北京积水潭医院，125 g/袋，批号：150604、150605、151101)；α-玉柏碱对照品[凯立德生物医药技术(上海)有限公司，596-55-4，含量：98.0%]；升麻素苷对照品(中国食品药品检定研究院，111522-201511，含量：94.8%),升麻素对照品(中国食品药品检定研究院，111710-200602，含量：100.0%),异5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(中国食品药品检定研究院，111523-201509，含量：95.8%),亥茅酚苷对照品(中国食品药品检定研究院，111714-201501，含量：100.0%)；甲醇(色谱纯),水(重蒸馏水)。

2 溶液制备

2.1 对照品储备液的制备 分别精密称取对照品α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷各适量，分别置5个不同的20 mL量瓶中，用50%甲醇分别溶解并稀释至刻度，摇匀，即得单一浓度的对照品储备液(α-玉柏碱0.515 mg/mL、升麻素苷对照品0.813 mg/mL、升麻素对照品0.474 mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品0.409 mg/mL、亥茅酚苷对照品0.435 mg/mL)。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别依次量取上述各对照品储备液：1.0、5.0、2.5、5.0、2.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(α-玉柏碱0.010 3 mg/mL、升麻素苷对照品0.081 3 mg/mL、升麻素对照品0.023 7 mg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品0.040 9 mg/mL、亥茅酚苷对照品0.017 4 mg/mL)。

2.3 供试品溶液的制备 取藤药适量，粉碎成细粉，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得藤药供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别称取除伸筋草外和除防风外的其他16味药材各1份，严格按照藤药制备工艺和供试品溶液的配制方法，分别制得伸筋草阴性对照溶液和防风阴性对照溶液。

3 色谱条件

采用Phenomene C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流速：0.8 mg/mL；柱温：25 ℃；进样量为10 μL；流动相A：甲醇，流动相B：水梯度洗脱[1-6](0～15 min，45.0%A；15～27 min，45.0%A→56.0%A；27～42 min，56.0%A→70.0%A；42～50 min，70.0%A→45.0%A)；0～15 min时在248 nm[7]波长下检测α-玉柏碱，15～50 min时在254 nm[8-9]波长下检测升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷。

4 方法学考察及含量测定

4.1 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，将其置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到一系列浓度的混合对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以质量浓度X(μg/mL)作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围如表1所示。

4.2 专属性实验 在上述色谱条件下，分别取伸筋草阴性对照溶液、防风阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液进样测定，记录色谱图。阴性对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1，结果表明，在本条件下，5种待测定成分不受处方中其他药味的影响。

4.3 精密度考察 取上述混合对照品溶液，按上述规定的色谱条件重复进样6次，记录α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的峰面积，分别计算这5个组分峰面积的RSD值。结果显示，其RSD依次为1.13%、0.85%、1.07%、0.94%和1.11%，表明仪器精密度良好。

4.4 重复性试验 取批号：150604的藤药样品6份，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，分别计算α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量，并计算所测5个组分含量的RSD，结果所测显示，5个组分的RSD依次为1.79%、1.54%、1.63%、1.59%和1.80%，表明本方法重复性良好。

表1 线性关系实验结果

图1 藤药含量测定的HPLC色谱图

4.5 加样回收率试验 取批号为150604已知含量的藤药适量，粉碎成细粉，称定6份，每份1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL、50%甲醇25 mL，加热回流提取1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为加样回收样品试液。按照上述色谱条件及检测方法，计算5个组分的回收率及RSD，结果见表2。

5 样品含量测定

取3批藤药，按上述制备方法制备供试品溶液，在上述的色谱条件下进样测定，结果见表3。

6 讨论

6.1 液相色谱条件的选择与优化

6.1.1 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水、乙腈-水不同比例为流动相体系的梯度洗脱分离，结果表明，以甲醇-水按照文中的流动相比例进行梯度洗脱时，所测α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷均能达到很好分离，所测各成分色谱峰峰型较好。

6.1.2 流速的选择 本实验还考察了流动相流速(0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min) 对各成分峰分离度及峰形的影响，结果表明，以0.8 mL/min的流速对所测5个成分(α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷)进行测定时，样品与对照品均能获得良好的峰形。

6.2 检测波长的选择 取上述各对照品储备液，用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果α-玉柏碱在波长248 nm处有较大吸收，因此，选择248 nm作为α-玉柏碱含量测定波长；升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷在254 nm处均有较大吸收，因此，选择254 nm作为该4种成分的测定波长。

6.3 提取溶剂的选择 本实验考察了不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇、乙腈)、不同提取方式(加热回流、超声处理)和不同提取时间(30 min、60 min、90 min)对样品中所测各成分定量测定的影响，结果表明，50%甲醇加热回流提取 1 h效果最佳。

7 结论

本实验所建立的HPLC波长切换法同时测定藤药中α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷含量的方法，操作简便，重复性好，可以有效地控制藤药的产品质量。

表2 α-玉柏碱、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的回收率

表3 含量测定结果(mg/g)

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Simultaneous determination of five constituents in Teng Yao by HPLC wavelength switching method

ZHANG Rui1,ZHANG Jing1,XU Bao-hai1*,XU Yan-zhao2

(1.Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China;2.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China)

Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of five components in Teng Yao.Methods The chromatographic analysis was carried out on an Phenomene C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was methanol (A)-water (B) at 0.8 mL/min in gradient elution mode which was 45.0% A from 0 to 15 min,45.0%→56.0% A from 15 to 27 min,56.0%→70.0% A from 27 to 42 min,70%～45% A from 42 to 50 min.The column temperature was set at 25 ℃,and detection wavelength was set at 248 nm (0～15 min,α-obscurine) and 254 nm (15～50 min,prim-o-glucosylcimifugin,cimifugin,5-O-methylvisammioside and sec-o-glucosylhamaudol).Results Five components were determined by HPLC,including α-obscurine,prim-o-glucosylcimifugin,cimifugin,5-O-methylvisammioside and sec-o-glucosylhamaudol.The average recoveries and the correspondingRSDwere 98.63% (1.60%),97.82% (1.45%),99.18% (1.48%),97.18% (1.29%)and 98.19% (1.80%),respectively.The linearity was good (r≥0.999 1) in the concentration ranges of 5.15～103.00 μg/mL,8.13～162.60 μg/mL,4.74～94.80 μg/mL,4.09～81.80 μg/mL and 4.35～87.00 μg/mL.Conclusion Five components in Teng Yao are effectively analyzed by HPLC wavelength switching method,and the method is accurate,reproducible with high sensitivity,which can be applied to the quality control of Teng Yao.

Teng Yao;α-obscurine;Prim-o-glucosylcimifugin;Cimifugin;5-O-methylvisammioside;Sec-o-glucosylhamaudol

2016-05-11

1.北京积水潭医院，北京 100035；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201701020