郑书国，朱元美，陶善珺，郑浩文，任尤楠，赵梦秋，杨解人，吴元洁

(1. 皖南医学院药理教研室，安徽 芜湖 241002；2. 安徽人口职业学院基础医学教研室，安徽 池州 247009；3. 安徽中医药大学中医基础学教研室，安徽 合肥 230038)

丹酚酸B对间歇性高糖诱导的JNK活化和INS-1细胞凋亡的影响

郑书国1，朱元美1，陶善珺1，郑浩文1，任尤楠1，赵梦秋2，杨解人1，吴元洁3

(1. 皖南医学院药理教研室，安徽 芜湖 241002；2. 安徽人口职业学院基础医学教研室，安徽 池州 247009；3. 安徽中医药大学中医基础学教研室，安徽 合肥 230038)

丹酚酸B；INS-1细胞；2型糖尿病；间歇性高糖；JNK；凋亡

近年来研究发现，由于存在胰岛素抵抗和胰岛功能缺陷，加之饮食控制不佳、用药不当等原因，糖尿病患者除表现为高血糖外，还常出现明显血糖波动，表现为血糖水平在波峰和波谷之间持续震荡的一种不稳定状态[1]。大量研究表明，血糖波动较持续性高血糖更易诱导胰岛β细胞凋亡，加重胰岛功能障碍，这也是糖尿病胰岛功能进行性减退的主要原因之一[2]。然而，目前临床仍无有效措施完全克服糖尿病患者血糖水平波动。因此，抑制血糖波动所致的胰岛β细胞凋亡，就成为保护胰岛功能、延缓糖尿病发生发展和改善糖尿病预后的有效措施。

丹酚酸B(salvianolic acid B, Sal B)是从唇形科植物丹参中提取的水溶性成分，具有抗氧化、抑制血小板聚集等多种药理活性[3]。近年来研究发现，Sal B可明显改善2型糖尿病糖脂代谢紊乱[4]，并可有效改善糖尿病肾病、动脉粥样硬化等多种并发症[3]，但对其确切机制至今仍未明确。本研究采用体外培养的大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)，观察Sal B对间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡及胰岛素分泌的影响，并探讨其可能机制，阐明Sal B改善糖尿病作用机制，以为临床用于防治糖尿病提供依据。

1 材料

1.1 药物与试剂 INS-1细胞株，上海艾睿生物科技有限公司；Sal B(>98%)，南京春秋生物工程有限公司； RPMI 1640培养基、胎牛血清，Hyclone公司；β-actin、p-JNK抗体，Abcam公司；JNK抗体、辣根过氧化物酶标记二抗、蛋白定量试剂盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；胰十二指肠同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox-1，PDX-1)抗体，CST公司；细胞凋亡检测试剂盒，上海贝博公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器 高速冷冻离心机(5417 R)，德国Eppendorf公司；Thermo Fisher多功能酶标仪，芬兰Thermo有限公司；流式细胞仪，美国BD公司；PowerPac300 型电泳仪、Mini PROTEAN 转膜系统，美国Bio Rad公司；FluorChem FC3 化学发光凝胶成像系统，美国ProteinSimple公司。

2 方法

2.1 细胞培养 INS-1细胞在37℃、5% CO2、饱和空气湿度条件下培养于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清、11.1 mmol·L-1葡萄糖、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素、1 mmol·L-1丙酮酸钠、50 μmol·L-1β-巯基乙醇)，待细胞生长至近融合时，0.25%胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行以下实验。

2.2 细胞活力检测 细胞活力采用MTT法检测。INS-1细胞接种于96孔培养板(1×104/孔)，24 h后更换培养液。细胞随机分为对照组(Control)、间歇性高糖组(IHG)、Sal B高(Sal B 10 μmol·L-1)、中(Sal B 1.0 μmol·L-1)、低剂量组(Sal B 0.1 μmol·L-1)。Sal B各组加入相应浓度Sal B预孵24 h。除对照组外，其余各组加入高浓度葡萄糖(33.3 mmol·L-1)，孵育12 h，更换为普通浓度葡萄糖(11.1 mmol·L-1)，持续12 h，连续3 d。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL孵育4 h。弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡混匀，570 nm测定吸光度(OD)值。

2.3 胰岛素分泌功能检测 INS-1细胞以1×105/孔的密度接种于24孔培养板，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，PBS洗涤后加入含5.6 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液，37℃孵育30 min。弃培养液，分别加入含5.6 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液孵育1 h，收集上清液，ELISA法检测胰岛素含量。

2.4 细胞凋亡水平检测 INS-1细胞以1×106/孔的密度接种于6孔培养板，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，0.25%胰酶消化后将细胞收集于离心管中，预冷PBS洗涤2次，每管加入Annexin V结合液400 μL悬浮细胞。在细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀，4℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液，4℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

2.5 Western blot检测 将INS-1细胞接种于6孔培养板(1×106/孔)，细胞分组及处理同2.1项下。收集细胞后RIPA裂解液冰浴裂解细胞，12000 g、4℃离心15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，转膜、封闭后分别加入JNK、p-JNK、PDX-1和β-actin抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL发光显色，凝胶图像分析系统拍照并分析条带光密度，结果以p-JNK/JNK和PDX-1/β-actin表示。

2.6 细胞内ROS水平测定 INS-1细胞以接种于96孔培养板(1×104/孔)，细胞分组及处理同2.1项下。弃培养液，PBS洗涤后加入含10 μmol·L-1二氯荧光素二乙酯(dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)的无血清培养液，37℃孵育20 min。弃培养液，无血清培养液洗涤细胞3次，荧光酶标仪检测各孔荧光强度(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。

3 结果

3.1 Sal B对INS-1细胞活力的影响 由Fig 1可见，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞活力较对照组明显下降(P<0.01)，而与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞活力(P<0.05或P<0.01)，提示Sal B可有效减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤(Fig 1)。

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

3.2 Sal B对INS-1细胞胰岛素分泌的影响 由Fig 2可见，基础状态下INS-1细胞胰岛素分泌水平较低，而在高浓度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下，其胰岛素分泌量明显增加。当暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞基础状态和葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平均明显下降(P<0.01)，提示间歇性高糖损伤了INS-1细胞胰岛素分泌功能；与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞基础状态和葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平(P<0.05或P<0.01)，提示Sal B可有效改善间歇性高糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌功能损伤。

3.3 Sal B对INS-1细胞凋亡的影响 正常培养条件下，INS-1细胞凋亡水平较低，而给予间歇性高糖刺激72 h后，细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，表现为凋亡早期和凋亡晚期细胞均明显增加；与Sal B预孵可明显抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)，这一结果与Sal B增强INS-1细胞活力、促进胰岛素分泌作用一致，提示Sal B减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤、改善胰岛素分泌功能与抑制细胞凋亡有关(Fig 3)。

Fig 2 Effect of Sal B on insulin

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

3.4 Sal B对INS-1细胞JNK活化的影响 由Fig 4可见，正常培养条件下，INS-1细胞JNK活化水平较低，而暴露于间歇性高糖72 h后， JNK活化水平明显升高(P<0.01)，说明间歇性高糖可明显诱导JNK活化。当INS-1细胞与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖时，JNK活化水平明显下降(P<0.05或P<0.01)，这一作用与Sal B抑制INS-1细胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡与抑制JNK活化有关。

3.5 Sal B对INS-1细胞PDX-1蛋白表达的影响 暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞PDX-1蛋白表达水平明显下降(P<0.01)，而与Sal B预孵可明显提高INS-1细胞PDX-1蛋白水平(P<0.05，P<0.01)，这一结果与Sal B抑制INS-1细胞凋亡、增加胰岛素分泌作用一致，提示Sal B减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤与上调PDX-1蛋白表达有关，见Fig 5。

3.6 Sal B对INS-1细胞内ROS水平的影响 由Fig 6可见，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞内ROS水平明显升高(P<0.01)，而与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖，细胞内ROS水平明显下降(P<0.05或P<0.01)。

4 讨论

高血糖是糖尿病最典型的临床特征之一，长期高血糖一方面可引起各种急慢性并发症，另一方面又可诱导胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素分泌进一步减少，血糖进一步升高，形成恶性循环。同时，由于胰岛功能减退，葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力明显下降，加之广泛存在的胰岛素抵抗，致使餐后血糖水平常明显升高，引起血糖剧烈波动[5]。大量研究表明，血糖波动较持续性高血糖更易诱导胰岛β细胞凋亡，加重胰岛功能障碍，且血糖波动幅度越大，糖尿病预后越差，这也是糖尿病病情进行性加重的主要原因之一[6]。因此，有效抑制血糖波动所致的胰岛β细胞凋亡将是改善糖尿病及其并发症的有效措施之一。本研究结果显示，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞凋亡水平明显升高，细胞活力和胰岛素分泌能力均明显下降，这一结果与文献报道一致[7]。与Sal B预孵可明显抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡，提高细胞活力和胰岛素分泌能力，提示Sal B可有效抑制间歇性高糖诱导的胰岛β细胞凋亡，改善胰岛功能，这一发现与体内研究结果基本一致[8]。由于本研究采用了更符合糖尿病临床特点的间歇性高糖环境，因此该研究结果可更客观地反映Sal B在体内对胰岛β细胞的保护作用，这为应用Sal B改善糖尿病胰岛功能提供依据。

A～E: Representative flow cytometric dot plots. A: Control; B: IHG; C: Sal B (10 μmol·L-1); D: Sal B (1 μmol·L-1); E: Sal B (0.1 μmol·L-1); F: Apoptotic rate of INS-1 cells.**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

**P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs IHG group

Fig 5 Effect of Sal B on PDX-1 protein

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

Fig 6 Effect of Sal B on intracellular

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

大量研究表明，高血糖引起胰岛β细胞凋亡的机制与诱导氧化应激有关[9]。高血糖尤其是间歇性高糖可通过多种途径促进ROS产生，并可损伤机体抗氧化酶活性，诱导氧化应激状态[10]。由于胰岛β细胞表达的抗氧化酶水平较低，故其更易受到氧化应激损伤[11]。ROS既可直接损伤细胞生物膜中多不饱和脂肪酸及胞内蛋白质、DNA等生物大分子，诱导细胞凋亡，也可通过激活应激敏感性信号通路，启动细胞凋亡进程[12]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，与多种疾病的发生发展密切相关。ROS可通过直接或间接等多种途径激活JNK信号通路，活化的JNK一方面可促进Fas L、Bim等促凋亡蛋白表达，另一方面可抑制Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表达，从而导致线粒体膜通透性增加，细胞色素C等凋亡诱导因子从线粒体释出，启动凋亡进程[13]。体外研究显示，抗氧化剂可有效抑制高血糖诱导的JNK活化和胰岛β细胞凋亡[14]，这些发现为应用抗氧化剂改善糖尿病胰岛功能提供了依据。本研究结果显示，暴露于间歇性高糖72 h后，INS-1细胞内ROS和JNK活化水平均明显升高，这一结果与文献报道一致[15]。当INS-1细胞与Sal B预孵后再暴露于间歇性高糖时，细胞内ROS和JNK活化水平均明显低于间歇性高糖对照组，说明Sal B可明显抑制间歇性高糖诱导的ROS产生和JNK活化，这一作用与Sal B抑制INS-1细胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制间歇性高糖诱导的INS-1细胞凋亡与改善氧化应激状态、抑制JNK活化有关。本研究从ROS-JNK信号通路初步揭示了Sal B抑制INS-1细胞凋亡的分子机制，这一结果将为进一步探讨Sal B保护糖尿病胰岛β细胞的机制奠定基础。

此外，本研究结果还显示，间歇性高糖可明显抑制胰十二指肠同源盒-1(PDX-1)蛋白表达。作为胰岛β细胞特异表达的转录因子，PDX-1具有抑制β细胞凋亡、促进胰岛素合成及分泌等多种生理作用，是维持胰岛正常功能的重要因素之一[16]。ROS可减少PDX-1 mRNA表达，降低PDX-1与胰岛素启动子结合活性，下调胰岛素基因转录[17]。活化的JNK也可磷酸化PDX-1并使其发生核质易位，抑制胰岛素基因转录，导致胰岛素合成和分泌减少[18]。Sal B可明显提高INS-1细胞PDX-1蛋白水平，提示Sal B抑制INS-1细胞凋亡、改善胰岛素分泌能力，与改善氧化应激状态、增加PDX-1表达有关。

综上所述，本研究采用了更符合糖尿病临床特点的间歇性高糖环境，从ROS介导JNK活化信号通路揭示了Sal B对INS-1细胞凋亡的抑制作用及其分子机制。该研究为进一步阐明Sal B改善糖尿病胰岛细胞功能的机制奠定基础，并将为临床应用于改善糖尿病胰岛功能提供依据。

(致谢：本实验在皖南医学院药理学教研室中药药理三级实验室完成，在此表示感谢。)

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Effect of salvianolic acid B on intermittent high glucoseinduced JNK activation and INS-1 cell apoptosis

ZHENG Shu-guo1, ZHU Yuan-mei1, TAO Shan-jun1, ZHENG Hao-wen1, REN You-nan1, ZHAO Meng-qiu2, YANG Jie-ren1, WU Yuan-jie3

(1.DeptofPharmacology,WannanMedicalCollege,WuhuAnhui241002,China; 2.DeptofBasicMedicine,AnhuiVocationalInstituteofPopulation,ChizhouAnhui247009,China; 3.DeptofBasicTheoryofChineseMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the effect of salvianolic acid B (Sal B) on c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation and apoptosis of INS-1 cells induced by intermittent high glucose. Methods INS-1 cells were preincubated with Sal B for 24 h, followed by exposure to intermittent high glucose (IHG, 11.1 mmol·L-112 h, 33. 3 mmol·L-112 h) for 72 h. Cell viability was assessed by MTT assay and cell apoptosis was evaluated by flow cytometry. Glucose induced insulin secretion capacity and intracellular reactive oxygen species (ROS) contents were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and a fluorescent probe DCFH-DA, respectively. Levels of JNK activation and PDX-1 protein expression were determined by Western blot analysis. Results Sal B significantly alleviated IHG-induced cell injury and apoptosis, with glucose induced insulin secretion capacity improved evidently (P<0.05 orP<0.01). Preincubation with Sal B notably decreased intracellular ROS and JNK activation in INS-1 cells, while the level of PDX-1 protein was increased markedly (P<0.05 orP<0.01). Conclusion Sal B is capable of ameliorating IHG-induced cell injury and apoptosis in INS-1 cells, which might be derived from suppression of JNK activation and up-regulation of PDX-1 protein expression.

salvianolic acid B; INS-1 cells; type 2 diabetes; intermittent high glucose; JNK; apoptosis

时间：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.026.html

2016-09-27，

2016-11-15

国家自然科学基金资助项目(No 81102626)；安徽省高校省级自然科学研究重点项目(No KJ2015A192)；皖南医学院大学生科研资助金资助项目(No WK2015S26)

郑书国(1967-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学和中药药理学，E-mail：zhengsg2000@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.013

A

1001-1978(2017)01-0068-06

R-332；R284.1；R322.57；R329.25；R345.57；R587.1摘要：目的 观察丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对间歇性高糖诱导的大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化和细胞凋亡的影响。方法 INS-1细胞与丹酚酸B预孵24 h后暴露于间歇性高糖(11.1 mmol·L-112 h，33.3 mmol·L-112 h)72 h。MTT法测定细胞活力，ELISA法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力，荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)水平，流式细胞术检测细胞凋亡水平，Western blot法检测胰十二指肠同源盒-1(PDX-1)蛋白表达和JNK活化水平。结果 丹酚酸B可明显减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡(P<0.05，P<0.01)，提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力(P<0.05，P<0.01)；与丹酚酸B预孵可明显降低细胞内ROS水平、抑制JNK活化，并提高PDX-1蛋白表达水平(P<0.05，P<0.01)。结论 丹酚酸B可有效减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡，提高胰岛素分泌水平，其机制可能与降低细胞内ROS水平、抑制JNK活化和上调PDX-1蛋白表达有关。