任仪鹏 张 蕾 史悦怡 步荣发

人源化小鼠模型(Humanized Mouse Model)是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用做人类疾病体内研究(in vivo study)的活体替代模型。

口腔鳞癌的免疫治疗[1]已经是目前的研究热点。虽然动物自身的免疫系统和人类存在相似点，但是区别也非常大。所以需要建立一种可以在一定程度上模拟人类免疫状态的动物模型。这种模型介于动物模型和人体临床试验之间，具有明确的免疫缺陷并允许人类免疫细胞在其体内移植及扩增。在以往的口腔鳞癌动物试验中最常使用的是缺少T细胞的裸鼠，可是在构建人源化动物模型和进行免疫相关研究方面却并不可靠。SCID-beige鼠是一类免疫重度缺陷的小鼠，可用于人源化小鼠模型的建立。本研究的目的就在于建立人源化SCID-beige鼠模型并将其应用于口腔鳞癌免疫研究之中，初步评估其建模效果。

1.材料和方法

1.1 试验动物及细胞 SCID-beige鼠30只，购于北京维通利华实验动物技术公司。4-5周龄，体重20g-25g，雌、雄性均可。在解放军总医院动物实验中心无菌层流条件下饲养，水、食物及填料均高压灭菌。饲养温度22℃，湿度55%，12小时白/昼节律。整个实验的过程都需要在无菌条件下进行。

肿瘤细胞系：为了评估的全面性，选用了三株常用的人舌鳞状细胞癌细胞系，TCA8113、SCC9、SCC25。

人外周血淋巴细胞(PBL)：来源于解放军总医院输血科健康献血者外周静脉血。

1.2 细胞培养 TCA8113、SCC9、SCC25细胞培养于高糖DMEM培养基(10%热灭活新生牛血清，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，根据细胞生长状态换液传代。传代及试验前需用0.25%胰蛋白酶溶液消化。

1.3 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立

1.3.1 分离人外周血淋巴细胞 全血常规操作分离成分血后，无菌提取剩余血液成分回实验室处理；血与淋巴细胞分离液按1∶2比例混合；1500r/min离心15min；用胶头滴管先吸弃血浆层，再吸取白膜层至另一离心管中；加入生理盐水至总量40-45ml并混匀后，300g离心10min洗去分离液；重复洗涤1次；计数细胞并用生理盐水调整细胞密度至3×107/200ul待用。

1.3.2 PBL小鼠腹腔注射 当日新鲜分离的PBL细胞悬浮在生理盐水中，按照100μl/10g(体重)的标准，经腹腔注射200μl，共3×107个/只。

1.3.3 免疫重建后小鼠外周血免疫球蛋白的测定 4周后取小鼠尾静脉血，凝固后取血清。按照检测人免疫球蛋白定量试剂盒(IgG)的操作说明操作。

1.4 皮下荷瘤模型的建立 取上一步骤中可以检测出人IgG的小鼠，随机分为三组：1、TCA8113组；2、SCC9组；3、SCC25组。每组10只。首先检测三组IgG水平，分析没有组间差异后继续后续步骤。

收获对数生长期的TCA8113、SCC9以及SCC25细胞，分别制成单细胞悬液，生理盐水洗涤2次，台盼蓝染色后计数细胞，活细胞数大于95%，用生理盐水调整活细胞浓度为2.5×107/mL。将三种细胞悬液分别注射于小鼠背部皮下，每只小鼠注射100μL，即2.5×106个/只，无菌环境下饲养。密切观察小鼠成瘤情况，当肿瘤长至能测量后，每隔4日用游标卡尺测量皮下肿瘤长径和短径，用下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(cm3)＝长径×短径2×1/2。于接种肿瘤细胞4-6周(如肿瘤生长快速可在4周后)，乙醚麻醉后，摘眼球放血处死，分别取三组小鼠的肿瘤组织进行后续检测。

1.5 数据统计 数据统计采用chiss2004软件，进行组间差异的方差分析，然后SNK检验法进行组间比较，P＜0.05为有统计学意义的差异。

2.结果

2.1 Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型的建立 全部小鼠外周血中均可检测到human-IgG，浓度较高，平均达2.105g/L，成功建立了Hu-PBL-SCID-beige小鼠免疫重建模型(图1)，重建成功率100%。对小鼠进行随机分组后，统计结果显示组间IgG含量没有差异(图2)。

2.2 移植瘤模型的建立和肿瘤体积 分别将TCA8113、SCC9以及SCC25细胞于皮下接种小鼠，7-10d开始有瘤结节形成，成瘤率95%。之后肿瘤呈进行性生长。测量肿瘤生长速度组间无明显区别(图3)。最终肿瘤体积差异无统计学意义，Tca8113组 2.858cm3±1.188cm3、SCC9组2.119cm3±1.032cm3、SCC25 组 2.693cm3±1.152cm3(图4)。其中我们对TCA8113细胞移植瘤进行了病理切片检查，并与裸鼠移植瘤切片进行了对比，发现细胞形态没有出现特异性改变(图5)。

图1 资料SCID-beige鼠(建立移植瘤模型后，肿瘤部位如箭头所示)

图2 ELISA法检测小鼠体内human-IgG含量，三组差异无统计学意义(P＜0.05)

图3 三组移植瘤生长趋势相似

图4 小鼠处死前测量肿瘤体积差异不具有统计学意义，P＞0.05

图5 TCA8113细胞移植瘤形态无明显差异

3.讨论

以往的生命科学研究中最常使用的免疫缺陷模型是裸鼠，但是裸鼠体内虽然缺少T细胞，可是却具备有功能的B细胞和NK细胞，人类肿瘤可以成功移植到裸鼠,但是正常的人类细胞却为裸鼠所排斥。而SCID小鼠因为体内同时缺少T细胞和B细胞，从而成为了建立人源化动物模型的理想选择。自从1988年Mosier成功报导了将人外周血单核细胞(PBMC)输注给重度免疫缺陷鼠(SCID)鼠体内，并检测到人淋巴细胞的存在并具有生物学功能，后来，这种方法已广泛应用于癌症生物学，自身免疫，变态反应，传染和移植生物学等方面研究。

虽然具备以上优势，但SCID小鼠象裸鼠一样，其体内还残留有NK细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞等。并且在后天饲养过程中会重新出现免疫系统，也就是容易发生“免疫渗漏”。所以，为了使SCID小鼠固有的天生免疫系统失效，又将其与另外一种突变种小鼠beige鼠进行杂交[2]。由此获得的SCID/beige小鼠表现为T和B细胞功能缺陷且NK细胞功能和吞噬作用严重减弱[3]，其发生“免疫渗漏”的机率很低，且不会随着鼠龄的增加而上升。

SCID/beige双重突变型小鼠同时具有T/B细胞和先天性免疫系统缺陷，影响了NK细胞和吞噬细胞功能。因此，移植入小鼠体内的人PBMC成功率大为提高，虽然人B细胞还不能出现在小鼠的循环系统中，但是PBMC已经能够出现在淋巴器官中并且可以在血液中检测到人IgG水平的表达。因此，SCID/beige成为了一种很好的可以在体内进行人类免疫系统研究及其它疾病研究的动物模型。

建立人源化免疫动物模型的方式也有很多种，主要的有两种：(1)干细胞移植方式，这种方法虽然精确，但构建模型较慢[4]；(2)移植完全分化的人外周血细胞的方式[5]。本研究中我们采用了第二种方法，不仅是因为其快速构建人源化小鼠的快速方便，还因为这种方式可以更加准确的反应健康供者的免疫记忆状态。

本研究中为了更加接近人体内状况，采用了SCID/beige鼠以及人PBL腹腔注射的方法来构建hu-PBL-SCID-beige模型，模拟人的免疫环境。值得指出的是既往很多研究中小鼠重建免疫模型之前都要经过预处理，如为尾静脉注射抗NK细胞活性制剂，重建前进行亚致死剂量的放射线照射等[6,7]。目的都是降低免疫渗漏的发生率，提高重建成功的比率，但是即使如此目前仍然有着较高的重建失败率。将SCID-beige小鼠用于免疫重建则无需这些难以控制的步骤[8]。本研究同样未采取重建前处理措施，最终构建人源化小鼠免疫模型成功率100%，所有小鼠血液中均可检测出人免疫球蛋白的表达，并且水平较高。成功建立了hu-PBLSCID-beige模型。接着又采用了三种较常见的人舌癌细胞系进行肿瘤种植实验，结果提示均可成功建立种植瘤模型。目前国内外将人源化小鼠模型作为头颈肿瘤研究动物模型的方法较少，本次实验为此领域的应用和研究进行了初步探索，为今后模拟人体免疫环境并研究OSCC及免疫治疗方法提供了新的选择和参考。

[1] 任仪鹏,步荣发,张 蕾,等.肿瘤微环境中的相关免疫细胞[J].中华老年口腔医学杂志,2011,9(6):361-364

[2] Roder J,Duwe A.The beige mutation in the mouse selectively impairs natural killer cell function[J].Nature,1979,278(5703):451-453

[3] Mosier D E,Stell K L,Gulizia R J,et al.Homozygous scid/scid;beige/beige mice have low levels of spontaneous or neonatal T cell-induced B cell generation[J].Journal of Experimental Medicine,1993,177(1):191-194

[4] Lapidot T,Pflumio F,Doedens M,et al.Cytokine stimulation of multilineage hematopoiesis from immature human cells engrafted in SCID mice[J].Science,1992,255(5048):1137-1141

[5] Jr M K,Roychowdhury S,Bhatt D,et al.Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T-cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model:a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies[J].Blood,2005,105(3):1114-1120

[6] Jian-Hong W U,Zhang F,Zhao W,et al.Establishment and Identification of HU-PBL-SCID Mice Model of Human Bladder Cancer Model[J].Progress in Modern Biomedicine,2014

[7]Pearson T,Greiner D L,Shultz L D.Humanized SCID mouse models for biomedical research[J].Current Topics in Microbiology&Immunology,2008,324(324):25-42

[8] Lu Z,Pang M,Dong S,et al.The establishment of human esophageal cancer model in Hu-PBL-SCID mice[J].Cancer Research&Clinic,2015,27(6):381-384