董亚萍，谢欣燕，胡 鲲，杨先乐

（1.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；2.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275）

中草药延缓嗜水气单胞菌对恩诺沙星耐药性的研究

董亚萍1，谢欣燕2，胡 鲲1，杨先乐1

（1.上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；2.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275）

为了延缓主要淡水养殖病原菌——嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的耐药性，以嗜水气单胞菌ATCC 7966为出发菌株，评价了其对恩诺沙星、氟苯尼考、盐酸多西环素、复方硫磺间甲氧嘧啶钠和硫酸新霉素等抗菌药物的敏感性；并以恩诺沙星为受试药物，对ATCC 7966进行低浓度耐药性诱导，获得最小抑菌浓度（MIC）提高了256倍的耐药性菌株。测定了茉莉花、薄荷叶、连翘等26种中草药对嗜水气单胞菌耐药性的延缓作用，结果表明：板蓝根、射干、苦参、大青叶、车前草、连翘、黄芩及艾草8种中草药均具有延缓嗜水气单胞菌对恩诺沙星耐药性的作用，其中，连翘延缓耐药性的作用最为明显。复筛实验结果表明，经过20代接种后，连翘实验组的耐药性只上升了2倍（对照组上升了16倍）。

嗜水气单胞菌；恩诺沙星；耐药性；中草药

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是淡水水产养殖的主要病原，大量抗生素用来治疗由嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病[1]，但是随之而来的耐药性问题严重威胁了公共卫生安全[2]。药物在目前及将来很长一段时间都是防治动物病害的主要方式之一[3]。为了降低耐药性威胁，长期以来人们试图采取不同措施以延缓耐药性的产生，如改变药物剂型、药物的浓度、用药的温度以及用中草药的方式等。早在1962年就有报道称不同浓度的SDS对金黄色葡萄球菌的R质粒有不同程度的消除作用，在浓度为0.6%时能够达到100%的消除率[4]，在42℃高温的条件下也能消除某些抗生素的耐药性[5]，黄瑞玉等[6]研究发现连翘可以抑制多重耐药鲍曼不动杆菌对环丙沙星的耐药性。与用中草药的方法相比，其他方法有很大不足之处，例如消除效果随温度及用药浓度的变化波动较大[7]，若控制不当会给生产实践带来严重的后果。中草药能在一定程度上延缓药物抗性的产生，这一特性为水产养殖中日益严重的耐药性问题提出了新的解决思路。此外，中草药在水产养殖中有很大的发展前景，一方面，大量的中草药作为国标渔药被允许在水产养殖中作为杀菌、杀虫及抗病毒药物使用[8]；另外一方面，相比化学制剂，中草药具有良好的安全性，不仅可以达到抗菌、抑制耐药性的产生，同时起到保护环境、减少农药残留的效果[9]。

试验主要以淡水养殖病原菌——嗜水气单胞菌为研究对象，通过低剂量恩诺沙星诱导嗜水气单胞菌耐药菌株，并对能缓解其耐药性的中草药进行了筛选及评价，以期为解决养殖实践中抗菌药物的耐药性问题提出新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验菌株嗜水气单胞菌ATCC 7966（以下简称SS），来源于ATCC。

1.1.2试验药物恩诺沙星（CDCT-C13170000），纯度≥99.0%；氟苯尼考（CDCT-C13665000），纯度≥99.0%；盐酸多西环素（CDCT-C13084280），纯度为100.0%；硫磺间甲氧嘧啶钠（CDCT-C16998180），纯度≥99.0%；硫酸新霉素（CDCT-C15500900），纯度为100.0%。以上药物均购于北京世纪奥科生物技术有限公司。

26种用于试验的中草药：乌梅、败酱草、板蓝根、射干、大黄、苦参、大青叶、夏枯草、车前草、茉莉花、薄荷叶、连翘、知母、青蒿、白头翁、黄芩、鱼腥草、艾草、石榴皮、诃子、复方蒲黄、烟叶、苍术、蒲公英、紫草、娄仁，均购于奥淼中药材销售有限责任公司。

1.1.3培养基营养肉汤（批号为022010）、营养琼脂培养基（批号为022021）、MH琼脂培养基（批号为028050），购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1耐药菌株的筛选选取了嗜水气单胞菌标准菌株ATCC 7966为目标菌株，对其进行耐药性筛选，初步选出5种抗生素（恩诺沙星、氟苯尼考、盐酸多西环素、复方间甲氧嘧啶钠和硫酸新霉素）耐药性较强的菌株作为进一步试验对象。

1.2.2 5种抗生素对SS的最小抑菌浓度（MIC）的测定采用二倍稀释法测定5种抗生素对SS的MIC，即将0.2 mL浓度为1 280 μg/mL的药液分别加入含有1.8 mL浓度为5.0×105 CFU/mL菌液的试管中，至药物终浓度为0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、1 280 μg/mL，并设1个阴性对照组，于30℃ 200 r/min摇床振荡恒温培养24 h后观察结果。把无菌生长稀释度最大的药液浓度作为各试验菌株的MIC。

1.2.3耐药菌株的诱导将SS分别接种到初始浓度为1/2 MIC药物的MH培养基中传代培养，每隔2 d转种1次，将细菌接种到前次2倍药物浓度的MH培养基中，测定其MIC，直至培养菌株的MIC上升至耐药判定浓度范围，然后转接于无药平板中培养，每天转种1次，连续传代12 d，每3 d测定药物对各菌株的MIC，以判断耐药菌的稳定性，最后将获得稳定耐药的菌株命名为ATCC7966-RS（以下简称RS）并保种备用。

1.2.4对SS和RS进行中草药诱导及筛选出具有延缓菌株耐药性的中草药对SS和筛选出的耐药性较强的RS在添加有中草药成分的培养基上培养数代，并在普通培养基上稳定培养，选取具有抗菌作用的乌梅、败酱草、板蓝根、射干、大黄、苦参、大青叶、夏枯草、车前草、茉莉花、薄荷叶、连翘、知母、青蒿、白头翁、黄芩、鱼腥草、艾草、石榴皮、诃子、复方蒲黄、烟叶、苍术、蒲公英、紫草、娄仁等26种中草药，对进行过中草药诱导的菌株进行耐药性试验。

（1）中草药有效成分的提取：采用煎煮法对中药进行提取[10]。准确称取中药饮片50 g，分别加入清水，水量高出饮片约2～3 cm（质重的药物加水较少，质轻的药物加水略多），浸泡30 min，一煎、二煎、三煎的加水量逐步递减。先以武火煮沸，再调用文火保持微沸状态。一煎沸后煎煮20 min，二煎沸后煎煮15 min，三煎沸后煎煮10 min。将所有的滤液混合，浓缩至50 mL，使药物的最终浓度为1 g/mL，调节pH值至7.2～7.4，流通蒸汽灭菌20 min。冷却后放入4℃冰箱短期备用。

（2）中草药对RS耐药菌株的诱导：将RS和SS分别接种到含中草药浓度为30 mg/mL和不含中草药的MH培养基中传代培养，其中RS接种到含有中草药培养基中传代培养的作为试验组，其他组为对照组。每天转种1次，每隔5代测定药物对各菌株的MIC，观察MIC有无变化。

（3）延缓耐药性验证试验：在上述试验中筛选出来的具有回复突变作用的中草药，选取其中效果较好的几种，同时考虑到在养殖行业允许使用、并且常用的2种分别是黄芩和苦参，将以上中草药进行延缓耐药性验证试验。在试验组的50 mL MH液体培养基中分别加入浓度为30 mg/mL中草药，而对照组则不加任何中草药；再在各组的培养基中加入最小抑菌浓度的抗生素，完成试验所需培养基的配制。将敏感菌株分别接种到以上培养基中传代培养，每天转种1次，测定其MIC来验证中草药延缓耐药性的效果。

（4）具有延缓耐药性作用的中草药的复筛：将中草药分为5个处理组，分别是对照组（不含中草药）、1（连翘）、2（黄芩）、3（苦参）、4（板蓝根）；在1～4组的50 mL MH液体培养基中分别加入浓度为30 mg/mL中草药，而对照组则不加任何中草药；再在5个组的培养基中加入浓度为0.25 μg/mL（MIC）恩诺沙星。将SS分别接种到5个处理组的含有药物的培养基中传代培养，每天转种1次，在传到第10、20代时分别测定5个试验组的嗜水气单胞菌MIC的变化。

2 结果与分析

2.1 模式药物的筛选以及耐药菌株的诱导

经检测，恩诺沙星、氟苯尼考、盐酸多西环素、复方间甲氧嘧啶钠和硫酸新霉素对SS的MIC分别为0.25、2、8、1和1 μg/mL。其中，SS对恩诺沙星最为敏感，最小抑菌浓度为0.25 μg/mL。因此，试验将恩诺沙星作为模式药物来进行下一步的耐药诱导及延缓试验。以恩诺沙星作为受试药物，对SS进行诱导，经过连续传代12 d之后，敏感菌株的MIC由最初的0.25 μg/mL升高到64 μg/mL，MIC提高了256倍，且经过连续传代培养的耐药性可以保持。

2.2 具有延缓耐药性作用中草药的初筛

从表1可以看出，选取初步筛选的26种中草药进行试验，在传到第10代时测定其MIC，RS分别经板蓝根、射干、苦参、大青叶、车前草、连翘、黄芩、艾草等8种中草药诱导之后，其MIC分别是16、32、32、32、32、16、32、32 μg/mL。而其他18种中草药诱导后的MIC则没有发生变化。初步筛选结果表明，8种中草药具有延缓嗜水气单胞菌耐药性的作用，分别是板蓝根、射干、苦参、大青叶、车前草、连翘、黄芩、艾草。

表1 26种中草药对耐药菌株RS作用前后MIC的变化

经上述结果对比，连翘和板蓝根作用前后的MIC变化最为明显，均从64 μg/mL降低到16 μg/mL，而经其他6种中草药作用后的MIC均从64 μg/mL降低到32 μg/mL。相比于其他中草药，连翘和板蓝根的延缓作用效果较强。

2.3 具有延缓耐药性作用中草药的复筛

由表2可知，SS菌株在没有任何中草药的作用下（对照组），在添加恩诺沙星的培养基中培养，经过20代的接种后，MIC由原来的0.25 μg/mL上升到4.0 μg/mL，是初始的16倍；2、3、4组的MIC由原来的0.25 μg/mL上升到1.0 μg/mL，是初始的4倍；而1组在有连翘的作用下，经过20代的接种后，MIC由原来的0.25 μg/mL上升到0.5 μg/mL，仅为初始MIC的2倍。由此表明，这4种中草药均有延缓耐药性的作用，其中连翘的延缓作用最明显。

表2 SS菌株在中草药与抗生素同时作用前后MIC的变化（μg/mL）

3 结论与讨论

3.1 嗜水气单胞菌对恩诺沙星等的耐药性

嗜水气单胞菌作为一种致病性较强的革兰氏阴性菌，广泛分布在河口、淡水及沿海等水域[11]，能够引起流行性疾病的爆发[12]，带来严重的经济损失[13]。在生产实践中常用氟喹诺酮类药物来防治革兰氏阴性菌引起的疾病，其中恩诺沙星是嗜水气单胞菌最为敏感的药物，同时也是最常用的，对该致病菌有较好的抗菌作用[14]。有研究表明，氟喹诺酮类对嗜水气单胞菌的抑菌效果比四环素类强[15]，但是在实际用药过程中如果没有掌握好杀菌浓度，前者较后者更易导致病菌产生耐药性[16]。洪经等[17]对来自国内不同地区的40株嗜水气单胞菌进行了多种抗生素类的药敏试验，结果显示耐药性问题普遍存在，并且都有不同程度的多重耐药现象。Brook等[18]和陈谊鸿等[19]研究表明，在用氟喹诺酮类药物治疗嗜水气单胞菌引起的疾病时，由于抗生素的剂型、剂量不同均能引起不同程度的交叉感染，使该病的治疗变得更加困难。

3.2 延缓耐药性的方法

国内学者的研究大都集中在嗜水气单胞菌耐药的机制及机理等方面，近年来研究方向慢慢转向关于耐药性的预防和控制方面。大量文献显示，中草药具有抑制有害菌生长的作用，也可以消除耐药质粒[20-21]。韦嫔等[22]发现五倍子可以降低大肠杆菌耐药性，从而恢复该菌对抗菌类药物的敏感。陈晴等[23]研究表明黄柏不仅能抑制MRSA，同时还能消除其耐药质粒。有研究者用化学、物理等方法通过阻碍染色体或者质粒的复制、改变细胞膜的通透性以及抑制相关蛋白的合成来达到消除其耐药性的目的[24-30]，但是与中草药消除的方法相比较，前者会受温度、盐度等生产条件的影响从而效果并不稳定。近年来对中草药的研究日益增多，与抗生素配合使用将成为生产实践的一大亮点。

试验选取初步筛选的具有抑菌作用的26种中草药进行延缓耐药性试验，结果显示有8种中草药具有延缓作用，以连翘的效果最为明显，此结果验证了中草药具有延缓细菌耐药性的结果，与房文红等[31]研究黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响的结果一致。由此建议在生产实践中可以将中草药和抗生素类药物结合使用来治疗嗜水气单胞菌引起的疾病。这不仅为有效的防治该病提供了新的方法，同时还能延缓病菌耐药性的产生。

[1] 蔡丽娟，许宝青，林启存. 水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析[J]. 水产科学， 2011，30（1）：46-49.

[2] 肖 辉，苏振霞，单娟娟，等. 16种中草药提取物对嗜水气单胞菌的体外抑菌实验[J]. 水生态学杂志，2009，（3）：53-56.

[3] 张传亮，李槿年，汪兴生，等. 水产动物常见病原菌的耐药性分析及中草药体外抑菌活性的检测[J]. 中国微生态学杂志，2007，19（2）：152-158.

[4] Sonstein S A，Baldwin J N. Loss of the penicillinase plasmid after treatment of staphylococcus aureuswith sodium dodecyl sulfate[J]. Journal of Bacteriology，1972，109（1）：262-265.

[5] 贾爱卿，刘维红，郭爱珍，等. 一株猪源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性鉴定及其消除[J]. 微生物学报，2006，46（5）：789-795.

[6] 黄瑞玉，穆小萍，柏彩英，等. 连翘对多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵编码基因adebB的影响[J]. 中国病原生物杂志，2011，6（2）：111-114.

[7] 邱进杰，罗艳秋. 细菌耐药质粒消除剂研究进展[J]. 家禽科学，2009，（4）：39-42.

[8] 卢 静，王振宁，陈 锐，等. 几种中草药单体和抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性研究[J]. 水生生物学报，2013，37（6）：1128-1132.

[9] 金建玲，徐 柯，高培基. 中西药联合使用在应对细菌抗药性方面的优势[J]. 中医药学报，2011，39（4）：95-98.

[10] 张文青，龚一富，金 思，等. 中草药及其配伍对嗜水气单胞菌的抑菌作用[J]. 渔业科学进展，2012，33（1）：114-121.

[11] Zakiya S，Saeed K，Kidon S，et al. Molecular characterization of fluoroquinolone-resistant Aeromonas spp. isolated from imported shrimp[J]. Applied and Environmental Microbiology，2012，78（22）：8137-8141.

[12] 陆承平. 致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述[J]. 水产学报，1992，16（3）：94-100.

[13] Zhang D，Xu D H，Shoemaker C，et al. Experimental induction of motile Aeromonas septicemia in channel catfish (Ictalurus punctatus) by waterborne challenge with virulent Aeromonas hydrophila[J]. Aquaculture Reports，2016，（3）：18-23.

[14] 徐丽娟，王 浩，胡 鲲，等. 恩诺沙星控制嗜水气单胞菌性鲫败血症的防耐药用药方案[J]. 中国水产科学，2013，20（3）：635-643.

[15] 王美珍，陈昌福，刘振兴，等. 嗜水气单胞菌对四环素类和氟喹诺酮类药物的耐药性研究[J]. 华中农业大学学报，2011，20（1）：89-93.

[16] Pallares R，Fenoll A，Linare J. The epidemiology of antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae and the clinical relevance of resistance to cephalosporins, macrolides and quinolones[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2003，（22）：15-24.

[17] 洪 经，潘连德. 鱼源嗜水气单胞菌质粒的指纹图谱及其与耐药性的关系[J]. 水产学报，2010，（12）：1908-1916.

[18] Brook I，Elliott T B，Sautter T E，et al. In Vitro resistance of Bacillus anthracis Sterne to doxycycline, macrolidesand quinolones[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2001，（18）：559-562.

[19] 陈宜鸿，刘皈阳，陈世铭. 四环素诱导表皮葡萄球菌对氟喹诺酮类耐药性研究[J]. 中华医院感染学杂志，1999，9（4）：199-201.

[20] 彭元丽，邹 坤，陈国华．中药消除大肠杆菌耐药质粒研究[J].时珍国医国药，2009，20（1）：139-140．

[21] 王兴旺，胡 勇，宋伟舟，等. 苍术对鸡大肠杆菌耐药质粒消除作用的研究[J]. 重庆工学院学报，2006，20（2）：123-125．

[22] 韦 嫔，谭艾娟，黄弘宇，等. 五倍子降低大肠杆菌耐药性的效果[J].贵州农业科学，2015，43（7）：137-139.

[23] 陈 晴，谢鲲鹏，云宝仪，等. 黄柏等中草药对MRSA的抑菌作用及其对质粒的消除作用[J]. 微生物学杂志，2013，33（3）：54-57.

[24] 项裕财. R质粒的紫外线消除试验改进和体会[J]. 皖南医学院学，2001，20（2）：154.

[25] Heery D M，Powell R，Gannon F，et al. Curing of plasmid from E.coli using high- voltage electroporation[J]. Nucleic Acids Research，1989，17（23）：10131.

[26] Huang B W，Huang Z P，Guan X. Transformation of E.coli and Bacillus thuringiensis and their curing by electroporation[J]. Journal of Fujian Agricultural Univercity，1999，28（1）：43- 46.

[27] 王 云，朱巯兰，关显智. 不同因素对奇异变形杆菌R质粒消除的影响[J]. 中国微生态学杂志，1994，6（1）：35- 37.

[28] 杨春梅，马志平，王志鹏，等. 黄连素、溴化乙啶十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用[J]. 西北药学杂志，2000，15（2）：64-65.

[29] 李 林，喻子生. 不同理化处理对苏云金芽胞杆菌质粒稳定性的影响[J]. 华中农业大学学报，2000，19（1）：29-32.

[30] 陈 群，王胜春. 黄芩和黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究[J]. 广东医学院学报，1998，16（1- ）：1-3.

[31] 房文红，周 常，孙贝贝，等. 黄芩苷与甘草酸对恩诺沙星在异育银鲫体内代谢的影响[J]. 中国水产科学，2012，19（1）：154-160.

（责任编辑：夏亚男）

Effects of Chinese Herbal Medicine on Aeromonas hydrophila Resistance on Enrofloxacin

DONG Ya-ping1，XIE Xin-yan2，HU Kun1，YANG Xian-le1
（1. State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, PRC; 2. School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510265, PRC）

In order to slow down the development of drug resistance of Chinese herbal medicine on Aeromonas hydrophila, a major pathogen bacterium in aquatic animal, the sensitivity of Aeromonas hydrophila on Enrofoxacin, Florfenicol, Doxycycline hydrochloride, Compound Sulfamonomethoxine Sodium and Neomycin Sulphate was evaluated. Using Enrofoxacin as the model drug, ATCC7966 was induced by low concentrations of drug resistance, the minimum inhibitory concentration was rose 256 fold. Twenty six kinds of Chinese herbal medicine were determined to eliminate resistance of Ah, such as jasmine, mint leaves, forsythia and so on. The results revealed that Radix Isatidis, Rhizoma Belamcandae, Flavescent Sophora Root, Dyers Woad Leaf, Plantain, Forsythia, Scutellaria and Wormwood can delay the resistance of Ah on Enrofoxacin, and Forsythia had obviously elimination effect on Aeromonas hydrophila resistance. The result of re-sieving test showed that the drug resistance of Forsythia was increased by 2 fold (compared with 16 fold in control group) after 20 generations inoculation.

Aeromonas hydrophila; Enrofoxacin; resistance; Chinese herbal medicine

book=1,ebook=9

S941

A

1006-060X（2016）12-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.001

2016-09-27

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字[2014]3-4号）；公益性农业行业专项（201203085）；国家自然资源平台项目;上海海洋大学知识服务平台资助项目

董亚萍（1991-），女，河南新乡市人，硕士研究生，主要从事鱼类药理学与药代动力学研究。

胡 鲲