孙向平，陈梦雅，曾粮斌，严 准

（1.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128）

不同消毒剂对苎麻各器官内生菌分离效果的影响

孙向平1，陈梦雅2，曾粮斌1，严 准1

（1.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128）

以1 g/L升汞、2% 次氯酸钠、10 g/L苯酚、50 /L甲醛、20 g/L高锰酸钾和1 g/L硝酸银等6种消毒剂对苎麻的叶、茎、根进行表面消毒处理，通过平板计数法分别对培养12、24 h后苎麻样品分离出的内生菌数进行统计，结果表明：对于苎麻叶、茎和根不同部位的样品，分别以70%乙醇2 min+1 g/L硝酸银1 min、70%乙醇2 min+ 20 g/L高锰酸钾2 min和70%乙醇2 min+2%次氯酸钠2 min的消毒处理，内生菌分离效果相对更好；其中，茎部的内生菌生长主要集中在消毒后12～24 h；苎麻成熟期各器官内生菌数目由高到低排列依次为叶＞茎＞根。

内生菌；苎麻；消毒剂；分离

植物内生菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙，并与宿主协同进化的微生物[1-3]。植物内生菌具有促生、抗虫、抗菌等作用，在调节植物生长、促进植物抗病虫害、抗干旱、固氮等方面有较广泛的应用，并可作为生物工程菌为植物病虫害的防治提供新的途径[4]。

苎麻[Boehmeria nivea（L.）Gaud]，又叫“中国草”，起源于中国，属荨麻科苎麻属的多年生宿根性草本植物[5]。中国是世界上种植和使用苎麻历史最悠久的国家[6]，国内有关苎麻的研究主要集中在品种改良、遗传基因、组培快繁、抗性生理、栽培管理等方面[7-8]，而有关苎麻内生菌的研究目前较少。

植物表面消毒是分离植物内生菌的首要步骤，消毒的难点在于既要使表面彻底消毒，又要保证植物体内的内生菌不受伤害[9]。不同的消毒剂类型、消毒剂浓度和消毒时间等均直接影响表面消毒的效果。笔者对不同的表面消毒条件进行比较，以期为苎麻内生菌资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试样品2016年6月上旬，在中国农业科学院麻类研究所沅江试验基地选择生长良好、无病害的中苎1号健康植株为取样材料，取成熟期的根、茎、叶作为试验样品。

1.1.2培养基培养基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15 g/L。用NaOH调pH值至7.2，121℃，灭菌20 min。

1.1.3表面消毒剂供试表明消毒剂有：1 g/L升汞（AR，泸试）、2%次氯酸钠（AR，国产）、10 g/L苯酚（AR，国产）、50 g/L甲醛（AR，Greagent）、20 g/ L高锰酸钾（AR，国产）、1 g/L硝酸银 （AR，国产）。

1.2 试验方法

将样品清洗干净放置于通风阴凉处，使其表面水分蒸发干燥；采用70%乙醇作辅助表面消毒在前期对苎麻不同器官进行2 min的预消毒处理；分别采用升汞、次氯酸钠、苯酚、甲醛、高锰酸钾、硝酸银对苎麻的叶、茎、根做消毒处理，其中叶的处理时间为1 min，茎和根的处理时间为2 min；消毒后的植物材料用无菌水洗3次，在培养皿中至少晾干1 min；然后用无菌剪刀将样品剪细，加入10 mL PBS溶液，研磨；取100 μL研磨样品液涂布。印迹对照为消毒后清洗的无菌水100 μL涂布，环境对照为培养基空白对照。每个处理重复3次，37℃培养12 h、24 h 后计数。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂处理后培养12 h的内生菌分离效果

从表1可以看出，对于苎麻叶样品，1 g/L升汞、2%次氯酸钠和50 g/L甲醛消毒处理后均没有分离出任何内生细菌；而10 g/L苯酚、20 g/L高锰酸钾和1 g/L硝酸银消毒处理后，内生菌含量分别约为5.3×102、0.3×102和128×102CFU/g，差异显著；其中，以1 g/L硝酸银的消毒效果最为合适，既有效抑制了杂菌的污染，又不影响内生菌的活性。对于苎麻茎样品，2%次氯酸钠和50 g/L甲醛处理未能分离到内生菌，而采用1 g/L升汞、10 g/L苯酚、20 g/L高锰酸钾和1 g/L硝酸银处理分别分离到0.6×102、2.0×102、1.7×102和0.6×102CFU/g的内生菌落；其中，10 g/L苯酚和20 g/L高锰酸钾处理的消毒效果最为适宜。对于苎麻根样品，6种消毒剂处理后均分离到内生菌落，且差异显著；其中，以2%次氯酸钠处理分离到的内生菌落最多，达70.3×102CFU/g。试验中，环境对照处理均为阳性，印记对照处理除50 g/L甲醛处理外，其他处理均没有染菌。

表1 不同消毒剂处理后苎麻各部位培养12 h时内生菌分离效果的比较

2.2 不同消毒剂处理后培养24 h的内生菌分离效果

由表2可知，与培养12 h的处理相比，培养24 h对苎麻叶和根样品的内生菌分离影响不大，但对苎麻茎样品的内生菌分离有显著影响。培养24 h后，6种消毒剂处理的苎麻茎样品均分离到不同数量的内生菌，其中以120 g/L高锰酸钾处理的效果最好，内生菌含量为125.6×102CFU/g，其次为10 g/L苯酚的处理，内生菌含量为77.6×102CFU/g。试验中，苎麻叶样品中10 g/L苯酚的印迹对照，以及茎、根样品中120 g/L高锰酸钾的印迹对照均受到杂菌的污染，其他处理均没有染菌。

表2 不同消毒剂处理后苎麻各部位培养24 h时内生菌分离效果的比较

3 结 论

表面消毒的效果影响到后续内生菌的分离鉴定，消毒时间过短或者消毒剂浓度太低，会导致杂菌污染，消毒不彻底；而消毒时间过长或者消毒剂浓度太高，均会影响内生菌活性，导致内生菌分离不全。因此，寻找既能彻底进行表面消毒，又不影响内生菌活性的消毒剂及其用量对内生菌资源的开发利用尤为关键。试验结果表明，对于苎麻叶样品，采用70%乙醇2 min+1 g/L硝酸银1 min的消毒处理，内生菌分离效果较好；对于苎麻茎样品，采用70%乙醇2 min+20 g/L高锰酸钾2 min的消毒处理，内生菌分离效果比其他处理好；对于苎麻根样品，采用70%乙醇2 min+2%次氯酸钠2 min的消毒处理，内生菌分离效果相对更好；苎麻茎中的内生菌生长主要集中在消毒后12～24 h，苎麻成熟期各器官内生菌数目由高到低排列依次为叶＞茎＞根。

[1] Bayman P，Lebron L L，Tremblay R L，et al. Variation in endophytic fungi from roots and leaves of Lepanthes （Orchidaceae） [J].

NewPhytologist，1997，135： 143-149．

[2] Stone J K，Bacon C W，White J F. An overview of endophytic microbes： endophytism defined，Microbial Endophytes[M]. New York： Marcel Dekker，2000. 3-30．

[3] Sirrenberg A，Gobel C，Grond S，et al. Pinformospora indica affects plant growth by auxin production[J]. Physiologia Plantarum，2007，131（4） ： 581-589．

[4] 王志勇，刘秀娟，易 曲. 植物内生菌分离时表面消毒条件的比较[J]. 江苏农业科学，2014，42（8）：366-367.

[5] 中国农业科学院麻类研究所. 中国麻类作物栽培学[M]. 北京： 农业出版社，1992.

[6] 李宗道. 苎麻生理生化与遗传育种[M]. 北京： 农业出版社，1989.

[7] 刘飞虎，郭清泉，郑思乡，等. 苎麻种质资源研究导论[M]. 北京：中国农业出版社，2002.

[8] 熊和平. 麻类作物育种学[M]. 北京： 中国农业科学技术出版社，2008.

[9] 李军勤，殷小雯，宋培勇. 南方红豆杉内生真菌分离时的表面消毒方法探索[J]. 生物技术进展，2014，（6）：443-446.

（责任编辑：成 平）

Effects of Different Disinfectant on the Isolation of Endophytes in Different Organs of Ramie

SUN Xiang-ping1，CHEN Meng-ya2，ZENG Liang-bing1，YAN Zhun1
（1. Institute of Bast Fiber Crops Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, PRC; 2.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking leaves, stems, roots of ramie as materials, surface disinfection treatments were conducted by six kinds disinfectants as follows: 1g/L mercuric chloride, 2% sodium hypochlorite, 10 g/L phenol, 50 g/L formaldehyde, 20 g/L potassium permanganate, and 1g/L silver nitrate. The number of endophyte was counted after cultured 12 h, 24 h by plate count method. The results showed that: 70% ethanol 2min + 1g/L silver nitrate 1min treatment on ramie leaf surface sterilized endophyte separation better than others; 70% ethanol 2min + 20 g/L potassium permanganate separation surface disinfection is better than other treatments for ramie stem endophyte. 70% ethanol 2 min + 2% sodium hypochlorite for disinfection program is a good separation on ramie root endophyte. The number of bacteria endophyte during mature ramie is leaf ＞ stem＞ root.

endophyte; Boehmeria nivea (L.)Gaud; disinfector; separation

book=10,ebook=18

Q93-335

A

1006-060X（2016）12-0010-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.003

2016-09-09

中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2015-IBFC09）

孙向平（1985-），男，湖南新邵县人，助理研究员，主要从事植物内生菌及其应用研究。

严 准