张凤春，费英敏

(1.铁力市四宝生物科技有限公司，黑龙江铁力152500；2.黑龙江民族职业学院，哈尔滨150066)

林蛙皮抗菌肽研究进展

张凤春1，费英敏2

(1.铁力市四宝生物科技有限公司，黑龙江铁力152500；2.黑龙江民族职业学院，哈尔滨150066)

近年来外源性病原体的侵袭日益加重，急切需要从多种生物体中搜寻新的具有抗菌活性的药物，目前研究发现两栖类的生态类型多种多样且复杂多变，能够分泌出大量具有特殊结构、功能特殊的抗菌肽类物质，这种物质耐热性好、广谱抗菌活性强，能够为筛选抗菌药物提供重要研究信息。通过林蛙皮肤分泌物中的抗菌肽生物活性、抑菌机制、应用现状和研究价值等进行综述，为抗菌肽的深入研究提供重要的理论依据。

林蛙皮肤；抗菌肽；应用价值

抗菌肽(antibacterial peptides)又被称为抗微生物肽、抗肽生素，其由10～50个氨基酸残基部分组成，是带有正电荷和广谱抗菌活性的小肽。动物中的两栖类具有皮肤光润、湿滑的特点，这为大量微生物提供了舒适的生存环境[1]。但是历经生物的历史进化它们的皮肤形成了能够抵抗微生物入侵的保护机制，尤其是腹部、背部分泌的一些物质足以避免有害分子的入侵。蛙类相对于其他生物来说是皮肤含有数量最多的，而且含有种类更多的抗菌肽，其生态地位也是最高的，有惊人的种类和数量。

两栖类代表物种林蛙广谱性特点强，能够有效抑制真菌、革兰氏阴性菌、寄生虫、肿瘤细胞等多种细菌；还具有选择性毒性和在很低浓度就能够抑制微生物生长的高效性，同时还具备很强的活性，并且具有快速杀灭微生物能力[2]。目前，国内有很多公司正在研发长白山林蛙的药用价值，并获得了提取抗菌肽的国家专利，该项专利在国际可替代抗菌素的纯生物抗菌肽上添上了新的一笔。

蛙类皮肤抗菌肽目前已有很多报道。已经成为医药领域研究热点之一。本文结合最新研究进展讲述林蛙和抗菌肽结合对于对抗病毒生物活性，阻断病毒感染起到积极指导作用。

1 林蛙简介

林蛙(RanadybowskiiGuenther)，俗称田鸡、哈什蟆，属于两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙属(Rana)[3]。我国境内珍稀两栖类动物居多，这种珍稀动物能够药用、食补还具有良好的生态价值[4]。人们在研究中发现林蛙皮肤中含有特殊的分子结构和生理功能的活性物质较多，且破损后不易感染、自愈修复速度快等优点[5]。马涛等对分子生物学深入研究发现林蛙皮肤分泌液中含有的抗菌肽具有广谱高效的抗菌活性，同时还具有抗真菌的防御功能。中国林蛙是珍贵的药用、食用性动物，还能产生副产品林蛙油，对其深入的研究开发能够产生巨大的经济效益且具备广阔的发展前景。时至今日，国际上大量研究了两栖类动物皮肤分泌物，但国内对其研究还处于初级阶段。Mohamed等[6]在2000年将一种抗菌肽从蛙类皮肤中成功的提取了出来，且重新更名“Dermatoxin”，能够抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。Kim2001年在林蛙中提取的Brevinin-2Gub，具有促胰岛素释放作用[7]。而国内较早的研究是在医药方面，2002年田晓乐等[8]对制备林蛙抗菌肽喷雾剂及凝胶剂的工艺进行了优化。

2 抗菌肽简介

2.1 抗菌肽分类

按结构抗菌肽可分为四类：α-螺旋型抗菌肽，是质膜相互作用插入细胞膜形成孔洞改变细胞膜通透性的作用机制，代表类型为爪蟾抗菌肽[9]；β-折叠型抗菌肽是不形成孔洞前提下使多肽分子穿过磷脂双分子层来破坏磷脂分子有序排列的机制[10-11]；还有一种可以抑制DNA合成的无规则型的抗菌肽[12]；对细菌和真菌具有杀伤作用机理的最强小分子的LOOP型抗菌肽。

2.2 抗菌肽的抑菌机理

2.2.1 膜裂解机理。主要是α-螺旋结构的膜裂解作用在细菌细胞膜上，破坏了脂层的完整性而且造成穿孔，增大了膜的通透性造成细菌细胞膜的破裂并最终溶解了细胞壁，使内容物渗出达到细胞死亡的目的[13]。蛙类抗菌肽的氨基酸残基数在21～27个，具有碱性酸性的两亲α-螺旋结构，也容易与酸性细胞膜结合，这样的特点形成了跨膜离子通道并加强了导膜抗菌的裂解。

这种抗菌肽与传统抗生素抗菌体质不同，它是以物理方式在生物细菌细胞膜上作用的，对临床耐药性有很大的影响。此外，抗菌肽不会杀死正常的真核生物细胞，也不会损伤正常哺乳动物的细胞，但能有效的抑制杀灭细菌、真菌、病毒、原虫、原核细胞、病变的真核细胞等[14]。具有独特作用机制特点的抗菌肽具有抗菌谱不易产生耐药性和抗药性，促使医药领域将抗菌肽作为热点积极开展研究。

2.2.2 膜不裂解机理。这种抗菌肽没有α-螺旋肽结构，但是能抑制细胞壁和蛋白质的合成，作用在DNA、RNA，并且不破坏细菌的膜结构，还能够穿过细胞膜和核膜来攻击线粒体。还有一种机制是以细菌包内酶为靶向目标的，这种抗菌肽使细胞信号过程被影响从而达到抑菌目的效果，在电子显微镜观察下发现，非洲爪蟾中的抗菌多肽Magainin2可以使细胞内外抗微生物菌作用增强[15]。

2.3 抗菌肽的生物活性

抗菌肽的抗菌谱能够抑制40多个革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，还能杀伤和灭活很多真菌并具备抗病毒的作用，刘红玉等发现大蹼铃蟾中含有的抗菌多肽Maximin3能够抑制艾滋病病毒活性[16-17]。这对于抗艾滋病来说是飞跃性的发现[18]。同时经研究发现，非洲爪蟾的抗菌多肽在微摩尔浓度下还具有抗肿瘤作用，可以杀死肿瘤细胞且这种机制比杀伤细菌要复杂很多[19-20]。但抗菌肽中的部分抗菌肽还具有较高的溶血活性，即引起动物血细胞的溶解，这将限制其在医药方面的应用，这种抗菌肽溶血性高、疏水性高、两亲性高，有高度螺旋性结构，会对哺乳动物的细胞膜产生很强的毒性。

2.4 抗菌肽的应用价值

2.4.1 临床医学研究应用。国内研究通过两栖类动物例如中华蟾蜍皮肤上的研究，广泛的应用在中药和民族区域药上。例如美国费城制药公司在1990年对10种以上抗菌肽研究，通过青蛙皮肤的分子结构设计，试验出了抗肿瘤的新药的多肽分子，并完成了III期应用在口腔溃疡、脚趾溃烂等的临床试验上[22]。蛙类的抗菌肽广谱抗菌活性大，5min内就能快速杀菌，还能够避免细菌内产生毒素形成的脓毒症，不会造成致畸作用且愈合伤口快速的特点。

2.4.2 食品保鲜防腐研究应用。市面上防腐剂有苯甲酸钠、亚硝酸钠等都是具有毒性的保鲜剂，Zasloff M等研究发现，东北林蛙中的抗菌肽FSE31.5可作为食品保鲜的防腐剂，并且安全无毒天然可食用，在水果蔬菜和肉制品保鲜方面有很好的效果[24]。

2.4.3 农业生产领域的研究应用。我国是农业大国，抗菌肽转基因作物已经获得很大成功，例如应用在马铃薯和西红柿2种作物上已经取得了巨大的经济收益。王雅丽研究将非洲爪蟾抗菌肽基因移植到烟草中，可以提高烟草对抗感染力[25]。

3 抗菌肽研究进展

国内学者对于林蛙的研究方向主要集中在林蛙油的研究，包括林蛙油的组份及功能性质等方面，进行了初步分离和纯化林蛙皮肤分泌物中的抗菌肽[26]。通过间断性稳压电刺激等分离纯化方法，能分离出新的一种具备抑菌活性的抗菌肽，并命名为 AMP-1，这种抗菌肽能够杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和耐药性强的菌株。进行试验发现这种抗菌肽溶血活性只有1.108%，这种低溶血性能够更好的对抗肿瘤。白冰等[27]分离纯化了蟾蜍皮肤分泌物中的抗菌肽，分析对比两种活性肽的量及抑制细菌效果，发现蟾蜍中的抗菌肽的杀菌效果比林蛙类强。

很多其他国家进行40多年，对500多种蛙类皮肤分泌物进行了研究，Jadvinder Goraya等[28]，从北美蛙类：Ranaluterventris、Ranaberlandiieri、Ranapipiens皮肤中分离得到一系列抗菌肽，因结构不同被分成8个不同家族，这些家族能够很好的抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性。白冰等[29]研究发现具有广谱抗菌活性强溶血活性良好的蛙类皮肤分泌物中的一种抗菌肽Drevinin IE。

4 抗菌肽研究现状

抗菌肽的分子量大，使得来源困难，通过化学合成获得，又使得生产成本高、无法大量生产等很多问题，导致不能应用在临床研究上；研究至今仍不能全面了解其毒性和人体疼痛忍受程度，所以在浓度上不好把控，稳定性无法确定；抗菌肽在身体内很容易被蛋白酶水解，表达基因水平较低，只能通过化学修饰来进行包埋，但是分离纯化小分子相当困难，就目前而言这种分子结构与生物活性关系急需进一步的探究；现在基因工程虽然可以融合蛋白，但是在微生物中抗菌肽的基因表达存在不能杀死微生物的问题，还造成了抗菌肽免疫反应和稳定性的问题。在这种抗菌肽分子改造条件下使其能产生不含抗原性的蛋白酶，成为了现今研究课题的热点[30]。

5 林蛙抗菌肽研究展望

近年来林蛙类动物皮肤分泌物中抗菌肽研究成为了热议专题，中国和国际上的专家对合成和调控动物免疫防御系统分子水平上的机制进行了深入的研究，加强其在实际应用方面的价值，例如在医学、临床、食用等方面，想使其成为继青霉素之后的更强的抗菌类药物。通过对蛙类皮肤分泌物的研究发现，林蛙分泌的抗菌肽含量大、抑菌作用强，并能产生良好的经济效益，这为研究新型多肽类抗生素及抗菌肽结构功能关系提供了理论依据，也为研究分子生物结构提供了良好的模型条件。随着基因工程的研究的进一步发展，林蛙皮肤分泌物中的抗菌肽在临床、科研、农业上有着更加宽广的应用前景。

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Study on Research Progress of Antibacterial Peptides

Zhang Fengchun1, Fei Yingmin2

(1. Tieli City Sibao Biological Technology Co. LTD., Tieli 152500;2. Heilongjiang Vocational College for Nationalities, Harbin 150066)

Recently, The invasion of exogenous pathogens is increasing, and it is urgent to search for new antibiotics with antibiotics from various organisms. At present, it has been found that the ecological types of amphibians are diverse and complex, Structure, function of special antimicrobial peptides, this material is good heat resistance, broad spectrum antibacterial activity, can provide important research information for screening antibiotics. In this paper, the biological activity, antibacterial mechanism, application status and research value of antimicrobial peptides in skin exudates of Rana chensinensis were reviewed, which provided important theoretical basis for in-depth study of antimicrobial peptides.

Frog skin; Antibacterial peptides; Value

S966.3+5;R284.2

A

DOI.∶10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.030