徐 涛，刘吉华

(江苏省中药评价与转化重点实验室，中国药科大学，江苏 南京 211198)

苄基四氢异喹啉类生物碱的微生物转化

徐 涛，刘吉华*

(江苏省中药评价与转化重点实验室，中国药科大学，江苏 南京 211198)

苄基四氢异喹啉类生物碱广泛分布于木兰科、防己科、番荔枝科、罂粟科、芸香科、樟科、小檗科等植物中，具有抗肿瘤、镇痛、止咳、降压、抗菌、抗炎、免疫抑制等多种生理活性，吗啡、罗通定、可待因、青藤碱、罂粟碱等多种药物已应用于临床。鉴于其广泛的临床应用，苄基四氢异喹啉类生物碱的结构修饰成为研究的热点，微生物转化由于效率高、手性及立体选择性强、反应条件温和、成本低、反应过程绿色环保等特点，在天然产物的结构修饰中应用越来越广泛。本文综述了微生物转化在苄基四氢异喹啉类生物碱结构修饰中的应用，为更深入的研究苄基四氢异喹啉类生物碱提供一定的依据。

苄基四氢异喹啉类生物碱；微生物转化；综述

苄基四氢异喹啉类生物碱广泛分布于木兰科、防己科、番荔枝科、罂粟科、芸香科、樟科、小檗科等植物中[1]，具有多种生理活性，如乌头中的乌药碱(coclaurine)及去甲乌药碱(demethylcoclaurine)具有抗艾滋病病毒的作用[2]，防己中的粉防己碱(tetrandrine)具有抗肿瘤作用[3]，黄连、黄柏中的小檗碱(berbine)及其衍生物具有抗菌[4]、抗炎及抗血管生成[5]的作用，阿片中的吗啡(morphine)具有强烈的镇痛作用[6]等。根据其骨架类型不同可分为7类[7]：苄基四氢异喹啉类、双苄基四氢异喹啉类、阿朴啡类、吗啡烷类、原小檗碱和小檗碱类、普罗托品类、菲啶类。鉴于其广泛的药理活性及临床应用，对苄基四氢异喹啉类生物碱进行结构修饰，寻找新的先导化合物，成为当今研究的热点。

微生物转化是以细菌、霉菌等微生物及其产生的酶对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是酶促催化反应[8]。微生物转化具有效率高、手性及立体选择性强、反应条件温和、成本低、反应过程绿色环保等特点，其常见反应类型有：氧化还原反应、水解反应、糖基化反应、缩合反应、胺化反应、酰基化反应、脱水反应等[9]。1952年Peterson和Murray首先发现菌株RhizopusnigicansATCC6627b 可以将黄体酮转化为11-α-羟基黄体酮，解决了合成可的松等皮质激素中的最大难题，自此，微生物转化为药物的合成及结构修饰开辟了一条新的途径。

1 微生物转化在苄基四氢异喹啉类生物碱研究中的应用

近年来，微生物转化技术被广泛用于天然化合物的合成、结构修饰和改造、药物前体化合物的转化及药物代谢机制研究等，是获得结构新颖、独特、低成本、低毒性和高活性药物的重要途径[10]。基于微生物转化在天然产物中的广泛应用，本文总结其在苄基四氢异喹啉类生物碱结构修饰中的应用主要有以下几个方面。

1.1 新天然活性先导化合物的发现

利用微生物转化的方法对苄基四氢异喹啉类生物碱进行结构修饰，产生新的天然活性物质，结合药理活性的筛选方法，可以增加天然活性先导化合物的来源。Stabler等[11]利用双生柱孢菌Cylindrocarpondidymum转化2,2’-二聚吗啡(2-2’-dimorphine)产生新的吗啡生物碱衍生物10-α-S-羟基-2,2’二聚吗啡和10,10’-α,α’-S,S’-二羟基-2,2’-二聚吗啡。Agusta等[12]用植物内生菌CoelomycetesAFKR-3对小檗碱(berberine)和巴马汀(palmatine)进行微生物转化，发现植物内生菌CoelomycetesAFKR-3具有转化小檗碱和巴马汀(palmatine)的能力，转化产物分别为小檗碱7-N-oxide和巴马汀7-N-oxide，且7-N-oxide具有和小檗碱相同的抗菌活性。

1.2 制备微量天然活性物质

天然活性物质在植物中往往含量极微，利用传统的药材提取方法进行分离制备会消耗大量的植物资源，导致植物资源匮乏，化学合成法制备时反应复杂且成本高，利用微生物及其产生的酶对活性物质前体进行生物转化，可获得产物结构单一，立体选择性强的产物，例如左旋紫堇达明(l-CDL)是中药元胡中的痕量成分，是左旋四氢巴马汀(l-THP)的10位羟基化产物，与l-THP相比其镇痛活性更强且镇静催眠等副作用较弱[13]，徐田等[14]研究发现灰色链霉菌StreptomycesgriseusATCC 13273具有转化l-THP生成l-CDL的能力，并通过紫外诱变法对原始菌株进行诱变处理，经筛选获得有较高转化率的菌株，并对其生物转化过程进行优化，该转化反应具有高度的立体选择性，且转化效率高。

1.3 增强转化产物活性

青藤碱(sinomenine)具有抗炎、免疫抑制作用，临床上主要用于辅助治疗类风湿性关节炎[15]，但是青藤碱生物利用率很低，且有抑制胃肠功能的副作用，因此青藤碱的临床应用受到限制。为了改善其生物利用度，增强活性，邓张双等[16]研究了微生物催化青藤碱和芳基小分子的碳碳交叉偶联反应，将青藤碱、邻苯二酚与真菌单色云芝Coriolusunicolor进行共培养，转化产生一种青藤碱1位与邻苯二酚4位碳碳偶联的产物，该转化产物在SW982细胞中表现出很强的抑制白介素-6的活性，其抑制率高达96%，而青藤碱对白介素-6的抑制率只有12%。

吗啡烷类生物碱具有较强的镇痛活性，14位碳原子引入羟基可以极大的增强其镇痛活性，但是，化学方法很难进行14位碳原子的羟基化。Lister等[17]从罂粟种植的土样中分离得到一株放射型根瘤菌RhizobiumradiobacterR89-1，该菌株能转化可待因(codeine)生成14-羟基可待因，为了提高其生物转化率，对微生物转化条件及菌株的耐受性进行了优化，最终筛选得到高性能的转化菌株，该菌株在底物添加浓度为6.0 g/L时，可待因仍能完全转化为14-羟基可待因。

1.4 降低毒性

微生物受到外源物质刺激时，可将其转化为水溶性更高、毒性更低的物质，加速外源物质的代谢。Vacek等[18]建立了人肝脏细胞转化白屈菜红碱(chelerythrine)和二氢白屈菜红碱(dihydrochelerythrine)的生物转化模型，并用HPLC-MS技术对白屈菜红碱和二氢白屈菜红碱的转化产物进行分析，发现白屈菜红碱的主要代谢产物为二氢白屈菜红碱，二氢白屈菜红碱的代谢产物主要是氧位去甲基化产物，对两种代谢产物进行毒理学研究，发现在添加浓度为50 μmol/L时两种转化产物仍未表现出明显的细胞毒性，说明白屈菜红碱的生物转化过程其实是减毒的过程，因此，微生物转化产物安全性更高。

1.5 增加水溶性，提高生物利用度

有些苄基四氢异喹啉类生物碱的水溶性差，利用微生物转化在其结构中引入亲水性基团，可增加其水溶性，提高生物利用度。荷苞牡丹碱(dicentrine)具有较强的抑制乙酰胆碱酯酶作用[19]，Ding等[20]利用罗杰斯无性穗霉菌Clonostachysrogersoniana828H2对地不容中荷苞牡丹碱进行微生物转化，该转化反应具有高度的立体选择性，转化产物为4R-羟基荷苞牡丹碱，对转化产物与底物的药理活性进行研究，发现转化产物和底物都有较强的抑制乙酰胆碱酯酶活性，4位碳原子的羟基化对药理活性影响不大，但是转化产物的水溶性提高了近30倍，这为水溶性乙酰胆碱酯酶抑制剂的研发提供了新的思路。

1.6 利用微生物转化模拟体内代谢过程

许多药物在哺乳动物体内的代谢产物与微生物转化产物相似，因此在一定程度上可以利用微生物转化模拟药物在哺乳动物体内的代谢。Li等[21]用微紫青霉菌PenicilliumjanthinellumAS 3.510对左旋四氢巴马汀(l-THP)进行微生物化转化，并将微生物转化产物与l-THP在大鼠体内的代谢产物进行对比，期望建立一个微生物转化模型用来表征l-THP在大鼠体内代谢的过程。发现微生物转化l-THP生成左旋紫堇达明(l-CDL)、左旋紫堇杷明碱(l-corypalmine)、9-O-desmethyl-l-THP三种去甲基化产物。三种转化产物与l-THP在大鼠体内代谢产物结构相同，说明l-THP的去甲基化反应在微生物细胞内和大鼠体内有相同的代谢途径，在一定程度上可以利用微生物转化模型进行l-THP的体内代谢研究。

Vrba等[22]利用重组细胞色素P450酶和人肝细胞对巴马汀(palmatine)进行生物转化，期望通过巴马汀的体外转化来表征其体内代谢过程，利用LC-MS技术对其转化产物进行分析，结果表明巴马汀在人肝细胞内的代谢反应类型主要是氧位去甲基化，而重组酶CYP2D6及CYP1A2可以体外催化巴马汀的氧位去甲基化反应。因此在一定程度上，可以利用微生物转化研究药物在肝细胞内的代谢过程。

2 小结及展望

微生物转化反应一般是对原化合物某个位点的修饰，不会破坏底物的基本母核，转化产物为底物的类似物，但是结构的细微变化可能会导致其生物活性或理化性质发生较大的变化，例如羟基化产物可以增强原化合物的生物活性或增加其水溶性，氮氧化物也可增强原化合物的生物活性，去甲基化反应或脱氢还原反应可以降低原化合物的毒副作用等。但是，微生物转化在天然活性物质结构修饰中的应用仍存在一些问题，比如微生物转化产率较低，存在底物抑制或产物抑制作用等。随着基因组学的发展及基因工程技术的改进，通过新的方式诱变菌种或改建高效的基因工程菌，深入研究微生物转化的机制，将使微生物转化技术在越来越多的领域得到应用。

[1] 赵娜, 高峰, 刘彬,等. 苄基四氢异喹啉类生物碱的药理作用及其研究进展[J]. 药学实践杂志, 2015, 33(4): 313-315.

[2] KASHIWADA Y, AOSHIMA A, IKESHIRO Y, et al. Anti-HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera, and structure-activity correlations with related alkaloids[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2005, 13(2): 443-448.

[3] CHENG Z, WANG K, WEI J, et al. Proteomic analysis of anti-tumor effects by tetrandrine treatment in HepG2 cells[J]. Phytomedicine, 2010, 17(13): 1000.

[4] JING W, TENG Y, HUANG C, et al. The synthesis and antistaphylococcal activity of 9, 13-disubstituted berberine derivatives[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, 127: 424.

[5] PUND S, BORADE G, RASVE G. Improvement of anti-inflammatory and anti-angiogenic activity of berberine by novel rapid dissolving nanoemulsifying technique[J]. Phytomedicine International Journal of Phytotherapy & Phytopharmacology, 2014, 21(3): 307.

[6] HARTON L R, RICHARDSON J R, ARMENDARIZ A, et al. Dissociation of morphine analgesic effects in the sensory and affective components of formalin-induced spontaneous pain in male and female rats[J]. Brain Research, 2017, 1658: 36-41.

[7] UNWIN N, GAN D, WHITING D. The IDF Diabetes Atlas: providing evidence, raising awareness and promoting action[J]. Diabetes Research & Clinical Practice, 2010, 87(1): 2-3.

[8] HEGAZY M E F, MOHAMED T A, ELHAMY A I, et al. Microbial biotransformation as a tool for drug development based on natural products from mevalonic acid pathway: A review [J]. Journal of Advanced Research, 2015, 6(1): 17-33.

[9] 贺赐安, 余旭亚, 孟庆雄,等. 生物转化对天然药物进行结构修饰的研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2012, 24(6): 843-847.

[10] 牛红军, 王芃, 杨官娥. 微生物转化技术在中药研究中的应用[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(18): 346-349.

[11] PETER J S, PETER J H, NEIL C B. Transformation of 2,2′-Bimorphine to the Novel Compounds 10-α-S-Monohydroxy-2,2′-Bimorphine and 10,10′-α,α′-S,S′- Dihydroxy-2,2′-Bimorphine by Cylindrocarpon didymium[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2001, 67(8): 3716-3719.

[12] AGUSTA A, WULANSARI D, PRAPTIWI, et al. Biotransformation of Protoberberine Alkaloids by the Endophytic Fungus Coelomycetes, AFKR-3 Isolated from Yellow Moonsheed Plant (Archangelisia Flava, (L.) Merr.)[J]. Procedia Chemistry, 2014, 13: 38- 43.

[13] 余伯阳. 中药生物技术[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2005: 274.

[14] 徐田，刘吉华，余伯阳,等. 微生物转化左旋四氢巴马汀产生左旋紫堇达明高产菌株的紫外诱变选育[J]. 药物生物技术, 2011, 18(4): 313- 316.

[15] CHEN D P, WONG C K, LEUNG P C, et al. Anti-inflammatory activities of Chinese herbal medicine sinomenine and Liang Miao San on tumor necrosis factor-α-activated human fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 137(1): 457-68.

[16] DENG Z S, ZHAO D, HU Y, et al. Biocatalyzed cross-coupling of sinomenine and 1,2-dihydroxybenzene by Coriolus unicolor[J]. 中国化学快报(英文版), 2012, 23(3): 321-324.

[17] KYSLIKOVA E, BABIAK P, STEPANEK V, et al. Biotransformation of codeine to 14-OH-codeine derivatives by Rhizobium radiobacter, R89-1[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic, 2013, 87(3): 1-5.

[18] VACEK J, PAPOUSKOVA B, KOSINA P, et al. Mass spectrometric investigation of chelerythrine and dihydrochelerythrine biotransformation patterns in human hepatocytes[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences, 2013, 941C(2): 17-24.

[19] INGKANINAN K, KHORANA N, SRIPRANG S. Acetylcholinesterase Inhibitor from Stephania suberosa Forman[J]. Naresuan University Science Journal, 2006, 3(1): 1-11.

[20] CAI L, DONG J W, ZHAO L X, et al. An improved water-soluble/stereospecific biotransformation of aporphine alkaloids in Stephania epigaea to 4 R -hydroxyaporphine alkaloids by Clonostachys rogersoniana[J]. Process Biochemistry 2016, 51 (8): 933-940.

[21] LI L, YE M, BI K, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the identification ofl-tetrahydropalmatine metabolites in Penicillium janthinellum, and rats[J]. Biomedical Chromatography, 2006, 20(1): 95-100.

[22] VRBA J, PAPOUSKOVA B, PYSZKOVA M, et al. Metabolism of palmatine by human hepatocytes and recombinant cytochromes P450[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2015, 102(102): 193-198.

TheMicrobialTransformationofBenzyltetrahydroisoquinolinesAlkaloids

Xu Tao, Liu Jihua*

(Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and Translational Research,China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids are widely distributed in Magnoliaceae, Menispermaceae, Annonaceae, Papaveraceae, Rutaceae, Lauraceae, Berberidaceae plants. which have varieties of physiological activities, such as anti-tumor, anti-HIV, analgesic, antitussive hypotensive, antibacterial, anti-inflammatory, immunosuppressive and so on. Some of them are widely used in clinical practice, such as morphine, rotundine, codeine, sinomenine, papaverine, etc. In view of its extensive clinical application, the structural modification of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids is a research hotspot. Recently, microbial transformation is more and more widely used in structural modification of natural products. Due to its high efficiency, strong chirality and stereoselectivity, mild reaction conditions, low cost and green environmental protection. In this paper, we have reviewed the application of microbial transformation in the structural modification of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids, which could provide a basis for the further study of benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids.

benzyltetrahydroisoquinolines alkaloids; microbial transformation; review

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.06.011

2017-03-17

江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

徐涛，男，硕士研究生，主要从事生物碱的微生物转化研究。E-mail:xt6111116@163.com

*通讯作者：刘吉华。E-mail: liujihua@cpu.edu.cn

Q819

A

1006-9690(2017)06-0050-03