张 达， 李姝玉， 王岩飞， 李奕萱， 易月娥， 高誉珊， 张淑静， 贾德贤， 王 谦

(北京中医药大学， 北京 100029)



·短篇论著·

黄芪与葛根素联用对KKAy小鼠肾脏内质网应激相关PERK通路的影响*

张 达， 李姝玉， 王岩飞， 李奕萱， 易月娥， 高誉珊， 张淑静， 贾德贤， 王 谦△

(北京中医药大学， 北京 100029)

目的： 研究黄芪注射液与葛根素注射液合用对小鼠糖尿病肾病内质网应激中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)通路相关因子的影响。方法: 将12周龄的雄性KKAy小鼠随机分成模型组和治疗组，每组14只，分别注射生理盐水或黄芪、葛根素注射液合剂，14只同龄雄性C57BL /6J小鼠为正常组。于16周龄时处死小鼠，电镜观察各组小鼠肾脏形态改变，通过real-time PCR和Western blot法检测PERK、真核起始因子2α(eIF2α)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的mRNA及蛋白表达。结果: 模型组及治疗组小鼠肾小管上皮细胞细胞核、内质网和线粒体肿胀。模型组PERK、eIF2α及GRP78的mRNA及蛋白表达均高于正常组(P<0.05)，治疗组较模型组下降。结论: 黄芪注射液同葛根素注射液联用可能通过减少PERK、eIF2α及GRP78的表达降低2 型糖尿病KKAy小鼠肾脏过强的内质网应激。

KKAy小鼠; 黄芪； 葛根素； 糖尿病肾病； 内质网应激

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的信号途径是糖尿病过程中各脏器实质细胞损伤早期反应的一个共性机制，在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制起重要作用[1-2]。而近年来的研究发现葛根素注射液与黄芪注射液的使用可以明显降低糖尿病肾病患者尿蛋白总量，明显改善血脂及血液流变学指标，对减轻肾脏病变、缓解症状、提高临床疗效均有裨益[3-4]，然而该作用的机制还不甚明确。本实验拟通过观察黄芪注射液联合葛根素注射液对KKAy糖尿病小鼠肾脏内质网应激中蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)及葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)的mRNA及蛋白表达的影响，探讨中药黄芪和葛根防治DN的机理。

材 料 和 方 法

1 试剂和仪器

黄芪及葛根素注射液分别购自成都地奥九泓制药厂和浙江康恩贝制药股份有限公司；提取及逆转录RNA所用试剂盒均购自Promega；Western blot实验所用抗体购自Abcam；血糖测量仪及试纸购自Bayer。离心机(Eppendorf)；透射电子显微镜(JEOL)；real-time PCR 仪(ABI)；凝胶成像仪(Alpho Innotech Fluor Chem)。

2 实验动物

SPF级KKAy雄性小鼠28只，许可证编号为SCXK(京)2009-0004；C57BL/6J雄性小鼠14只，许可证编号为SCXK(京)2009-0007，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。动物饲养于北京大学医学部实验动物中心屏障系统，每笼2只，每日更换垫料、饲料及水。高脂饲料及普通饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

3 方法

3.1 动物分组及给药 KKAy小鼠给予高脂饲料； C57BL/6J小鼠给予普通饲料，均为普通饮水，每日更换垫料，KKAy小鼠高脂饲养至12周龄时，将随机血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠确定为糖尿病小鼠，随机分为模型组(14只)和治疗组(14只)，C57BL/6J小鼠全部进入正常组。按照注射液药品说明书，根据体重计算，治疗组小鼠每日先腹腔注射黄芪注射液(0.003 mL/g)，随后葛根素注射液(0.0013 mL/g)，模型组及正常组小鼠均每日注射等体积生理盐水。以上小鼠均2只1笼，各组动物均自由饮食，于16周龄时处死动物。

3.2 形态学检测 打开小鼠腹腔后取双侧肾脏组织，将所取小鼠肾组织迅速用锋利的刀片取1 mm×1 mm×1 mm左右的肾皮质(冰上操作)，固定于2.5%的戊二醛(pH 7.4)中，制作超薄切片，电镜下观察超微结构。

3.3 Real-time PCR检测mRNA的表达 处死小鼠打开腹腔后取双侧肾脏组织，取出后置于液氮罐中保存，而后使用TRIzol提取肾脏组织细胞中的RNA，将其逆转录得到cDNA，之后采用real-time PCR方法检测小鼠肾组织中内质网应激通路中PERK和eIF2α的mRNA表达情况，所用引物序列详见表1。用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达率，其中ΔΔCt是按照以下公式计算的，计算公式：ΔCt=Ct(样品基因)-Ct(内参照)；ΔΔCt=ΔCt(治疗组或模型组基因)-ΔCt(对照组基因)。最后，计算表达比率。依据以上公式，选取GAPDH作为内参照，求GRP78、eIF2α和PERK的相对表达量。

表 1 Real-time PCR引物序列

3.4 Western blot实验检测蛋白表达 小鼠肾脏组织经蛋白提取并变性后依次电泳、转膜、封闭、 I抗孵育、 II 抗孵育后曝光，检测内质网应激PERK通路中相关蛋白PERK、eIF2α及GRP78的蛋白表达情况。

4 统计学处理

数据采用SAS 9.4软件处理，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采取Bonferroni校正的t检验进行各组均数的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠的一般状况

治疗组及模型组小鼠均有精神不振，体毛缺乏光泽，活动迟缓，并出现多饮、多食、多尿，与正常组相比，体重增加，而且随着周龄增加症状加重，治疗组部分小鼠上述情况得到一定改善。在整个实验过程中，C57BL/6J小鼠未死亡；模型组死亡2只，其原因为被同笼小鼠或自己咬伤，治疗组死亡2只，原因可能与糖尿病酮症酸中毒、感染或其它相关并发症有关，最终共计38只小鼠完成实验，其中正常组14只，模型组12只，实验组12只。

2 肾脏形态学观察

透射电镜观察可见正常组小鼠肾小球结构完好，足突排列有序，肾小管上皮细胞线粒体结构清晰，基底膜清楚完整。模型组小鼠肾小球基底膜轻度增厚，可见肾小球系膜基质增多，足突排列出现紊乱、融合；肾小管上皮细胞胞浆疏松，内质网及细胞核肿胀，线粒体肿胀、嵴消失。与同周龄模型组小鼠相比，治疗组小鼠肾小球毛细血管基底膜增厚程度有所减轻，肾小球系膜区基质轻度增多；肾小管上皮细胞线粒体、内质网肿胀有一定改善；肾间质胶原纤维增生不明显，见图1。

Figure 1.The ultrastructural changes of the renal tissues in all groups observed under electron microscope. A: normal group; B: model group; C: treatment group.

图1 小鼠肾组织的电镜观察

3 Real-time PCR检测PERK及eIF2α的mRNA表达

由表2可知模型组PERK及eIF2α的mRNA表达量均高于正常组，治疗组的表达量则低于模型组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而治疗组的表达水平同正常组比较差异没有统计学显著性。

表 2 小鼠肾脏组织中PERK和eIF2α的mRNA表达

Table 2. The mRNA expression of PERK and eIF2α in the mouse renal tissues (Mean±SD.n=6)

GroupPERKeIF2αNormal1．00±0．001．00±0．00Model1．53±0．12∗1．45±0．64∗Treatment1．21±0．19#1．23±0．20#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group．

4 Western blot实验检测eIF2α、GRP78和PERK蛋白的水平

模型组的eIF2α、GRP78和PERK蛋白表达高于正常组和治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗组略高于正常组,但两者之间的差异无统计学显著性，见图2、表3。

讨 论

内质网的稳态失衡即为内质网应激。为消除这种应激，内质网迅即启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，未折叠蛋白反应是包括蛋白合成暂停、内质网分子伴侣和折叠酶表达上调、内质网相关性蛋白降解等在内的一种综合性反应[5]。存在于内质网膜上的需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、PERK、活化转录因子6(activating transcription factor 6， ATF6)3种蛋白分子是感受内质网内应激信号的一类跨膜感受蛋白[6]。正常情况下, 这3种信号感受蛋白都分别与内质网腔内 GRP78结合形成复合物，且处于无活性状态。当内质网中未折叠蛋白蓄积增加时，GRP78分子转而结合内质网中不断增多的新生未折叠蛋白，从而导致这3种感受蛋白从其 GRP78复合物中解离出来[7-8]，启动后续反应，解离后的PERK形成同源二聚体，发生自身磷酸化而激活，激活的PERK 使真核翻译起始因子eIF2α的第5l位丝氨酸发生磷酸化而活化，使80S核糖体的组装和蛋白合成被抑制，下调几乎所有的蛋白质翻译，进而减缓了内质网腔内蛋白质的合成，减少错误蛋白的折叠，减轻内质网负担，维持细胞内环境平衡。虽然活化后的eIF2α能抑制大部分蛋白的翻译，但却能特异性的上调ATF4的表达，ATF4的表达上调可以激活CHOP启动凋亡，在细胞的损伤不可修复的情况下使细胞发生凋亡[9-10]。综上所述，GRP78、PERK和eIF2α的表达情况可以一定程度上反映细胞的内质网应激状态，尤其是PERK通路的状态。

Figure 2. Western blot was performed to detect the protein expression of PERK, eIF2α and GRP78 in the renal tissues of the mice with different treatments.

图2 Western blot检测小鼠肾组织中PERK、eIF2α和GRP78蛋白的表达

表3 小鼠肾组织中PERK、eIF2α和GRP78蛋白的表达

Table 3. The protein xpression of PERK, eIF2α and GRP78 in the mouse renal tissues (Mean±SD.n=6)

GroupPERKeIF2αGRP78Normal0．97±0．040．99±0．010．98±0．06Model1．17±0．04∗1．25±0．08∗1．32±0．10∗Treatment0．99±0．03#0．99±0．02#0．99±0．04#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group．

糖尿病肾病由糖尿病发展而来。糖尿病在中医论著中早有记载，多称为消渴症，消渴症的中医分型，通常将其分为阴虚热盛、湿热困脾、气阴两虚、阴阳两虚多种证型，但以阴阳两虚型最多见[11]，传统医学认为，阴阳两虚是贯穿其病情发展始终的主要病机，而肾阳虚衰是糖尿病肾病发展至后期的主要病机。葛根升阳生津，黄芪益气利水，临床葛根常与黄芪相须为用，治疗阴虚消渴，共奏滋阴清热之功效[12-13]。

课题组之前进行的前期实验对黄芪注射液联用葛根注射液的血清指标包括空腹血糖、甘油三酯、血肌酐、总胆固醇等及GRP78的mRNA的检测实验结果已经可以看出二者合用可以在一定程度对KKAy小鼠的症状有一定改善[14]，且GRP78的mRNA表达下降也可以猜测是降低了细胞内的ERS。本实验结果同前期实验结果共同说明，葛根素注射液联用黄芪注射液可以在一定程度上控制血糖和降低血脂，并且能够预防糖尿病肾病损害的发生，减轻病理性肾脏损伤，对肾脏有积极的保护作用，前期的光镜观察及本实验中的电镜超微结构观察等形态学检测结果中也支持了这种结论[14]，治疗组小鼠肾脏结构较模型组小鼠完整清晰，说明黄芪和葛根素联合用药能减轻糖尿病肾病肾脏功能和结构的损害。电镜观察肾小球超微结构，可见模型组小鼠相比治疗组小鼠的肾小球基底膜增厚，足突增宽、扁平，足突融合，足细胞的胞质空泡变性。这也与之前某些研究具有相同结论[15-17]。

在real-time PCR及Western blot实验的结果中显示模型组小鼠PERK和eIF2α的mRNA及上述指标及GRP78蛋白的表达最高，且相比于正常组的表达量差异较大，可以认为模型组小鼠由于糖尿病肾病发生了内质网应激。统计结果显示KKAy小鼠肾组织中GRP78、PERK和eIF2α的mRNA及蛋白表达均高于正常小鼠，证实在糖尿病肾病过程中存在内质网应激。研究结果还显示经黄芪注射液和葛根素注射液干预治疗后，KKAy小鼠GRP78、PERK和eIF2α的mRNA及蛋白表达降低，与此一致的是KKAy小鼠的血清生化指标也同时得到改善[14]。

综上所述，我们推测黄芪注射液联合葛根素注射液通过减少GRP78、PERK和eIF2α的表达，缓解糖尿病小鼠体内持续存在的ERS，从而保护肾功能，增加胰岛素敏感性而降低血糖。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effects of astragalus injection combined with puerarin injection on process of endoplasmic reticulum stress through PERK pathway in dabe-tic nephropathy mice

ZHANG Da, LI Shu-yu, WANG Yan-fei, LI Yi-xuan, YI Yue-e, GAO Yu-shan, ZHANG Shu-jing, JIA De-xian, WANG Qian

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:wangqianchai@163.com)

AIM: To investigate the effects of astragalus injection combined with puerarin injection on endoplasmic reticulum stress through PERK pathway in diabetic nephropathy mice. METHODS: Male KKAymice were randomly divided into model group (injected with normal saline) and treatment group (injected with astragalus and puerarin). The male C57BL/6J mice served as normal group. The mice were sacrificed 4 weeks after treatments for observing morphological changes under electron microscope. The renal tissues were collected to determine the expression of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels by real-time PCR and Western blot. RESULTS: Under electron microscope, the renal tubular epithelial cells in model group and treatment group showed the swelling of the nucleus, endoplasmic reticulum and mitochondria. The results of real-time PCR and Western blot showed that the expression of PERK, eIF2α and GRP78 at mRNA and protein levels in model group was higher than that in normal group (P<0.05), while that in treatment group was lower than that in model group. CONCLUSION: Astragalus injection combined with puerarin injection reduces the mRNA and protein expression of PERK, eIF2α and GRP78, thus inhibiting the endoplasmic reticulum stress in type 2 diabetic mice to protect the kidney function.

KKAymice; Astragalus; Puerarin; Diabetic nephropathy; Endoplasmic reticulum stress

1000- 4718(2017)01- 0166- 05

2016- 05- 05

2016- 10- 31

国家自然科学基金资助项目(No. 81072926)；北京中医药大学创新团队资助项目(No. 2011-CXDT-04)

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.028

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 010-64286965; E-mail: wangqianchai@163.com