梁嘉丽， 邝兆民， 杨 静， 秦佳佳

(暨南大学医学院中医学系，广东 广州 510632)



补肾阴及补肾阳法对化疗诱导的卵巢早衰大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平及卵巢颗粒细胞凋亡的影响*

梁嘉丽， 邝兆民， 杨 静， 秦佳佳△

(暨南大学医学院中医学系，广东 广州 510632)

目的： 观察化疗诱导的卵巢早衰大鼠接受补肾阴法和补肾阳法干预后，其外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及卵巢颗粒细胞凋亡情况。方法: 48只雌性SD大鼠随机分成对照(control)组、环磷酰胺(CTX)组、环磷酰胺+补肾阴(CTX+kidney yin)组、环磷酰胺+补肾阳(CTX+kidney yang)组。ELISA法检测各组大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平；末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测卵巢颗粒细胞凋亡；Western blot法检测卵巢Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果: CTX组大鼠外周血TNF-α、IFN-γ表达水平上升，卵巢颗粒细胞凋亡明显，卵巢中Bax蛋白明显增多，而Bcl-2蛋白明显减少。经本实验中补肾方药治疗后，外周血TNF-α、IFN-γ水平下降，颗粒细胞凋亡程度减轻，Bax蛋白减少，Bcl-2蛋白增多，部分指标变化以CTX+kidney yin组较为明显。结论: 补肾阴及补肾阳法可通过调控颗粒细胞凋亡相关的Bax、Bcl-2蛋白及外周血TNF-α、IFN-γ的水平，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，恢复卵巢功能、增强储备能力。

卵巢早衰； 补肾阴法； 补肾阳法； 化疗

化疗所致的卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)在临床上多表现为青年妇女的闭经、不孕及烦热盗汗、腰膝酸软等围绝经期症状体征，病理上表现为卵巢的萎缩、皮质纤维化、无始基卵泡等等。目前西医治疗既有疗效亦存隐忧。中医认为，肾主生殖，认识本病病机以肾虚为主，治疗以补肾为首。适当的中医药治疗有“简便廉验”的优势。本课题组前期研究结果显示，补肾方药能使各级卵泡及黄体数增加，提高体内雌二醇(estradial, E2)水平，降低外周血促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)水平，抑制抗卵巢抗体(anti-ovarian antibody, AoAb)产生，尤以补肾阴组作用显著[1]。在此基础上，本文继续研究化疗后补肾阴、补肾阳法对卵巢早衰大鼠的相关细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)表达、卵巢颗粒细胞凋亡的影响，以探索更切合化疗后卵巢早衰病机的补肾方法。

材 料 和 方 法

1 动物和主要试剂

SPF级雌性Sprague Dawley(SD)大鼠48只，3月龄，体重(220±15) g，来源于广州中医药大学动物实验中心，粤监证字2008A002。

金匮肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司)每20丸相当于4 g原生药。六味地黄丸(江苏康缘药业股份有限公司)每8丸相当于3 g原生药。用药剂量按人与大鼠体表面积折算的等效剂量比值0.018计算[2]。环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司。TNF-α、IFN-γ酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(Rapid Bio)；末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling, TUNEL)试剂盒(南京凯基公司)；Super EC Plus发光试剂盒(Thermo)；BCA蛋白定量试剂盒(博彩生物公司)。

2 主要方法

2.1 造模及给药 48只SPF级雌性SD大鼠适应性喂养1周，按随机数字表随机等分为：对照(control)组；CTX组；环磷酰胺+补肾阴(CTX+kidney yin)组；环磷酰胺+补肾阳(CTX+kidney yang)组。给药方法：第1～15天，control组大鼠腹腔注射生理盐水，每天1次，每次每只动物2 mL，连续15 d；其余3组大鼠首日按50 mg/kg剂量、第2～15天按8 mg/kg剂量腹腔注射CTX造模[3]。第16天开始，control、CTX组大鼠用生理盐水灌胃，每天1次，每次每只动物2 mL；CTX+kidney yin组大鼠用六味地黄丸按0.945 g/kg剂量溶于2 mL生理盐水后灌胃；CTX+kidney yang组大鼠用金匮肾气丸按1.260 g/kg剂量溶于2 mL生理盐水后灌胃，每天1次，连续28 d。

2.2 ELISA法检测大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平 对大鼠行腹主动脉取血，离心取血清后于-80℃超低温保存待检。检测严格按照试剂盒说明书操作，简要步骤：稀释标本及洗涤液→设置标准品→加样孵育→加第I抗体孵育→加酶标工作液孵育→加底物工作液孵育→终止并测吸光度(A)值。

2.3 TUNEL法检测颗粒细胞凋亡 严格按照凯基公司试剂说明书操作，简要步骤：石蜡样品脱蜡及水化，用蛋白酶K修复，封闭；滴加TdT酶工作液反应，滴加HRP工作液反应，使用DAB显色，苏木复染，显微镜观察拍照。镜下细胞核出现棕黄色颗粒判定为阳性细胞。显微镜下随机取3个视野，计算细胞凋亡指数(阳性细胞数/细胞总数×100%)。

2.4 Western blot法检测各组大鼠卵巢内Bax、Bcl-2蛋白表达 简要步骤：裂解卵巢组织，提取上清总蛋白；BCA法测量蛋白浓度；加入蛋白上样缓冲液电泳至溴酚兰线接近胶底；低温转膜后室温封闭；加Ⅰ抗、Ⅱ抗工作液进行免疫反应；化学发光；暗室压片，保存分析。

3 统计学处理

数据分析采用统计软件SPSS 19.0处理。检测结果以均数±标准差(mean±SD)表示。计量资料采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齐性，用LSD检验进行组间比较；若方差不齐，采用Tamhane’s T2法进行组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平

与control组比较，CTX造模后大鼠外周血中TNF-α、IFN-γ的表达明显上升(P<0.01)；经补肾药物治疗后，TNF-α、IFN-γ表达均有所下降(P<0.05)，其中CTX+kidney yin组IFN-γ水平低于CTX+kidney yang组(P<0.01),见表1。

2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况

Control组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡较少(P<0.01)，且凋亡细胞染色较浅；CTX组大鼠可见较多闭锁卵泡，凋亡细胞主要围绕闭锁卵泡，均匀散布于颗粒细胞中，且凋亡染色较深，卵泡腔内亦见染色；CTX+kidney yin组大鼠凋亡染色多存在颗粒细胞内层及卵泡液中，凋亡细胞较CTX组明显减少(P<0.01)，染色亦浅；CTX+kidney yang组大鼠可见较多的凋亡细胞，其凋亡细胞散在颗粒细胞各层，但在内层靠近卵泡液处染色较深，其凋亡数目及染色强度较CTX组弱(P<0.05)，但明显强于CTX+kidney yin组(P<0.01)，见图1、表2。

3 Western blot法检测大鼠卵巢中Bax、Bcl-2蛋白含量

CTX组卵巢中Bax蛋白表达较control组明显增多，而Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.01)。经补肾药物治疗后，Bax蛋白表达减少，而Bcl-2蛋白表达增多(P<0.01)，CTX+kidney yin组与CTX+kidney yang组组间差异无统计学意义，见图2。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平

Table 1. The levels of TNF-α and IFN-γ in serum of rats in different groups (ng/L. Mean ± SD)

GroupnTNF⁃αIFN⁃γControl100．16±0．250．38±0．08CTX111．09±0．48△△0．74±0．11△△CTX+kidneyyin120．83±0．10∗∗0．47±0．07∗∗CTX+kidneyyang110．90±0．09∗∗0．64±0．10∗##

△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsCTX group;##P<0.01vsCTX+kidney yin group.

Figure 1. Apoptosis of ovarian granulosa cells in rats (TUNEL,×100).

图1 TUNEL法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡指数

Table 2. Apoptotic index of ovarian granulosa cells in rats (%. Mean±SD)

GroupnApoptoticindexControl1036±12CTX11 78±21△△CTX+kidneyyin1249±14∗∗CTX+kidneyyang11 64±14∗∗##

△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsCTX group;##P<0.01vsCTX+kidney yin group.

讨 论

西方医学认为，卵巢受下丘脑-垂体-卵巢生殖轴调控；中医认为，肾主生殖，卵巢是“肾-天癸-冲任-胞宫”生殖轴功能实现的关键一环。卵巢储备的始基卵泡数目有限，而化疗容易损害颗粒细胞，可能使各级生长卵泡凋亡、始基卵泡过度激活、血管损伤及纤维化等[4]导致生殖轴的功能损害，使卵巢难以正常分泌性激素，排卵异常，加速储备耗竭而早衰。卵巢颗粒细胞的凋亡与卵母细胞的发育潜能密切相关[5]，细胞异常凋亡致卵泡闭锁是本疾病发生发展的本质因素，由多种因子介导调控。

卵巢早衰大鼠中，TNF-α和IFN-γ在卵巢组织的蛋白及基因表达增多[6-7]，IFN-γ可诱发增强颗粒细胞上MHC抗原的表达，激活IL-1、IL-2、TGF-β、TNF-α、FGF等一系列细胞因子产生自身免疫反应使卵泡闭锁[8]。TNF-α可致血管内皮损伤[9]，影响卵巢局部血运，使激素分泌及各级卵泡生长发育受阻；TNF-α能够通过神经鞘氨醇和ICE/CED3连接半胱氨酸蛋白酶通路[10]，诱导颗粒细胞及早期卵泡的凋亡[11]。

调控细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白中，抑制因子Bcl-2和促进因子Bax优势表达于生长卵泡的颗粒细胞，作用于卵巢生长发育的全过程，Bcl-2在发育中的黄体表达更强，Bax在退化的黄体中表达更强，二者对立地调控着卵巢颗粒细胞的凋亡水平[12]。当小鼠Bcl-2基因缺失，卵泡数量会减少[13]；Bcl-2转基因鼠则抑制卵泡闭锁，减少自发性的或由药物诱导的卵母细胞凋亡[14]。

本实验中，化疗诱导的卵巢早衰大鼠外周血中TNF-ɑ、IFN-γ表达水平升高，卵巢中Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增多，卵泡闭锁多而凋亡染色深；补肾药物干预后，TNF-ɑ、IFN-γ表达水平下降， Bcl-2蛋白表达增多、Bax蛋白表达减少，颗粒细胞凋亡受到抑制。结合本课题组前期实验结果，补肾方药可上调E2、下调FSH水平，增加各级卵泡和黄体数，说明补肾药物可通过调节TNF-ɑ、IFN-γ等多种细胞因子的表达，调节Bcl-2/Bax系统平衡，来延缓卵巢颗粒细胞凋亡，延缓各级卵泡闭锁，改善生殖轴的功能、增强卵巢储备能力。

Figure 2. The expression of Bcl-2 and Bax proteins detected by Western blot. Mean±SD.n=10～12.△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsCTX group.

图2 Western blot法检测卵巢中Bcl-2、Bax蛋白含量

部分指标结果中补肾之阴优于补肾之阳，与中医临症肾虚为主、阴虚更著的表现相符。故治疗上以补肾为主，调阴为佳。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Effects of tonifying kidney yin and yang on expressions of TNF-α, IFN-γ in peripheral blood and apoptosis of granulosa cells in chemotherapy-induced premature ovarian failure rats

LIANG Jia-li, KUONG Sio-man, YANG Jing, QIN Jia-jia

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jiajia_bamboo@163.com)

AIM: To treat the chemotherapy-induced premature ovarian failure (POF) rats with the methods of tonifying kidney yin and yang by observing the indicator changes in apoptosis of ovarian granulosa cells and related cytokines before and after medication. METHODS: SD rats (n=36) were chronically given intraperitoneal injection of cyclophosphamide (CTX) for 15 d in order to establish the animal model of POF. The rats were randomly divided into control group, CTX group, CTX+kidney yin group and CTX+kidney yang group. The levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) in the peripheral blood were detected by ELISA. The apoptosis of ovarian granulosa cells was observed by TUNEL method. The levels of apoptosis related proteins were determined by Western blot. RESULTS: After modeling, the levels of TNF-α and IFN-γ in the peripheral blood were significantly increased. The protein expression of Bax was up-regulated and Bcl-2 was down-regulated. The apoptosis of ovarian granulosa cells was significantly induced with a deep staining. After treatment with tonifying kidney yin and yang, the levels of TNF-α and IFN-γ in the peripheral blood were decreased, the protein expression of Bax was down-regulated and Bcl-2 was up-regulated, and the apoptosis of ovarian granulosa cells was reduced. CONCLUSION: The reserve function of the ovarian can be recovered by prescriptions of tonifying the kidney yin and yang via regulating the expression of TNF-α, IFN-γ, Bax and Bcl-2, and inhibiting the apoptosis of ovarian granulosa cells.

Premature ovarian failure; Method of tonifying the kidney yin; Method of tonifying the kidney yang; Chemotherapy

1000- 4718(2017)01- 0139- 04

2016- 05- 23

2016- 10- 28

国家自然科学基金资助项目(No. 81373805)；广东省社会发展领域科技计划(No. 2013B021600001)

R363; R271.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.023

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-85220244; E-mail: jiajia_bamboo@163.com