袁铭章，刘树堂，陈延玲，辛 励，刘锦涛

(青岛农业大学，山东 青岛 266109)

16S rDNA扩增子测序揭示长期定位秸秆还田对土壤细菌群落的影响

袁铭章，刘树堂，陈延玲，辛 励，刘锦涛

(青岛农业大学，山东 青岛 266109)

为探究典型的长期定位秸秆还田耕作模式对土壤微生物多样性的影响以及土地施肥变化与生态环境效应之间的关系，利用连续进行6年的长期定位秸秆还田试验，采用16S rDNA 扩增子测序技术，分析土壤细菌群落结构组成的情况。结果表明，土壤长期施入秸秆和有机肥可提升土壤细菌群落多样性及物种丰富度。秸秆还田后土壤中细菌优势种群为变形杆菌和酸杆菌。主成分分析显示，各处理间微生物种类及含量有明显差别。WC与WCN处理N、P、K等速效养分含量有明显差别。WCN处理中的N、P、K等速效养分，有机碳含量与蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活性显著高于WC。秸秆还田施用氮肥显著增加土壤养分含量，增强土壤酶活性，有利于土壤细菌群落的多样性和稳定性的提高，改善土壤生态环境，从而促进作物增产。

秸秆还田；16S rDNA；长期定位；细菌群落

秸秆还田技术不仅是回收利用秸秆的一种重要方式，还可以减少因秸秆焚烧造成的环境污染等问题[1]。长期秸秆还田不仅能够提升土壤细菌物种丰富度、微生物群落多样性，还有利于土壤养分循环及肥力的提高，提供良好的土壤生态体系[2]。土壤细菌是影响农田生态循环的重要因子之一[3]，与各种土壤环境中微生物活性密切相关，是评价土壤质量的重要生物指标[4-5]。随着有关学者对微生物种类的深入研究，微生物核糖体数据库得到了日益完善，16S rDNA 扩增子测序作为细菌等微生物的识别与鉴定的主要工具也得到了高度认可[6-7]。

迄今为止，对于潮土土壤细菌多样性研究，多数以其分布规律、酶活性等为基础进行研究土壤细菌群落结构以及代谢特征；而在分子水平上，特别是利用16S rDNA 基因测序技术对长期定位秸秆还田土壤细菌的微生物多样性进行的研究鲜见报道[8-9]。

本试验从土壤细菌微生态角度出发，运用DNA扩增因子测序技术，对长期不同秸秆还田施肥处理下的土壤细菌的物种丰富度、变化程度及物种均匀度进行了研究，揭示了农田生态系统的细菌群落组成与结构的基本差异，较为客观地反映了细菌群落的真实情况，从而为保护农田土壤生态系统的正确管理提供了合理的量化理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验设在山东莱阳长期定位试验站，非石灰性潮土。施肥前耕层土壤全氮量0.60 g/kg，全磷量0.64 g/kg，土壤有效磷16.34 mg/kg，土壤速效钾72.00 mg/kg，阳离子代换量为13.80 cmoL/kg，pH 值6.8，土壤有机质含量为5.01 g/kg。

试验始于2009年秋。开始试验设置5个处理：1季秸秆还田(WN)、2季秸秆还田(WC)、2季秸秆还田施氮肥(WCN)、单施有机肥(M)，具体施肥见表1。每个处理做空白对照，且做3次重复，随机分区排列，其间均设隔离板。

试验以冬小麦-夏玉米每年2作的轮作制进行，冬小麦品种为烟优361；夏玉米品种为鲁玉16号。尿素做无机肥，猪圈粪做有机肥，含全氮量2.1～3.0 g/kg，含全磷量0.48～2.20g/kg，有机质含量20～50 g/kg，干燥的玉米、小麦秸秆其全氮含量平均为1.93%、施用高低量均以与无机氮肥等含氮量计算。

表1 试验处理Tab.1 Experimental treatment

注：+.单季小麦；++.小麦-玉米。

Note：+.Single season wheat；+ +.Wheat and corn.

1.2 样品采集

土壤样品在2015 年玉米收获期采集，按“S”形多点采样法取表层(0～20 cm)混合土壤，混匀后作为该施肥处理的1个试验样品，取200 g 新鲜土壤进行冷存。

1.3 土壤养分的测定

有机质测定采用K2Cr2O7容量-外加热法；土壤的水解性N测定采用碱解扩散法；采用NaHCO3浸提P；K测定采用乙酸溶液浸提-火焰光度计法；用pHS-3c仪器测定pH值[10]。

1.4 高通量测序及数据处理

提取(CTAB法)样品的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测其纯度、浓度，并使样品进行离心至1 ng/μL。稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物High-Fidelity PCR，利用高效、高精度的酶进行聚合酶链反应，以确保扩增效率和准确度。引物对应区域16S V4区引物为515F-806R。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，产物浓度为2%，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用热凝胶回收试剂盒收集产品[11]。

1.4.1 Library 构建和测序 通过新英格兰生物公司的生物DNA数据库，比对模型中数据，合格后进行上机测序[12]。

1.4.2 Information分析流程 将原始数据进行拼接和过滤，然后基于Operational Taxonomic Units 进行Cluster和物种分类分析，这样能确保信息分析的结果更加准确、可靠。结合利用原始数据做出的物种注释，得到了每个样本的基本分析结果。同时，在CK、WN、WCN、WC、M处理的物种丰富度、多样性指数等进行分析的同时，对5个处理群落结构进行统计分析，对各层次的物种进行标注。最终，结合对秸秆还田不同施肥处理数据分析的基础上，再进行了多种多样的SCCA(物种多样性分析Cluster analysis of species composition)，PCA呈现了基因组成差异，并与环境因子进行了相关性分析[13-16]。

2 结果与分析

2.1 不同施肥对土壤养分的影响

与CK相比，长期秸秆还田(WN、WC和WCN)和有机肥(M)显著增加土壤全氮、碱解氮、有效磷、有机碳含量，尤其是长期秸秆还田与氮肥或有机肥单独应用，养分含量提高更显著。长期秸秆还田和施肥处理不影响土壤的酸碱度(表2)，但玉米产量有显著差异，主要规律为WCN>M>WN>WC>CK，与CK相比，玉米产量分别依次增加16.1%，13.6%，9.9%，7.6%。3种不同秸秆还田和有机施肥处理的土壤蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活力的影响均显著提高(表3)，其中，WC土壤酶活性最低，WCN酶活性最高，WN和M处理居中。

表2 不同处理土壤养分含量与pH值Tab.2 Different treatments of soil nutrient content and pH value

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。CK.对照；WC.玉米-小麦两季秸秆还田；WN.小麦秸秆还田配施276 kg/hm2氮肥；M.有机肥，6 000 kg/hm2猪粪；WCN.小麦玉米秸秆还田配施276 kg/hm2氮肥。表3-4同。

Note：The different small letters represent significant difference(P<0.05).CK.Control；WC.Maize-wheat season straw；WN.Wheat straw returned to the field with application of 276 kg/ha N；M.Organic fertilizer，6 000 kg/ha，pig manure；WCN.Wheat and maize straw returned to the field with 276 kg/ha N.The same as Tab.3-4.

表3 不同处理土壤蔗糖酶、脲酶、纤维素酶活性与玉米产量Tab.3 The activity of invertase，urease，cellulase and the yield of maize in different treatments

2.2 稀释曲线

对Illumina MiSeq/HiSeq 测序平台得到的下机数据进行预处理，获取Tags值，默认提供以97%和95%的一致性将序列聚类成为OTUs，绘制稀释曲线。如图1所示，测序数据量充足，各处理曲线趋向平滑，表明样品物种的丰富程度较高，本试验可信度较高，能够最大程度地反映各处理样品的信息。各处理中，M处理OTU数最高，其次为WCN。

图1 物种丰富度稀释D曲线Fig.1 Species richness dilution curve

2.3 物种分类鉴定结果

通过序列优化过程中获得了16 000多个有效读取，并计算了细菌群落丰富度指数，如表4所示。WCN、WN、WC、M样品OTUs值分别较CK高28.9%，23.9%，17.0%，16.5%。Shannon和Chaol表明，与CK处理相比，秸秆还田和有机肥处理显著提高土壤细菌群落多样性。

表4 97%的OTUs数据统计与rDNA丰富度和多样性指数Tab.4 97% OTUs data statistics and rDNA richness and diversity index

2.4 土壤细菌物种聚类OTU分析及物种注释

各测试样品结果进行了聚类分析，用数据分析软件对所有标签(默认情况下采用97%的一致性序列)将序列聚类成为有效值(OTUs)，并根据序列在所有样品中最小值进行聚类结果规范化处理，对秸秆还田5个处理样本数据进行初步统计。平均有效序列得到了290个OTUs，注释到11个门。

在土壤细菌物种聚类OTU分析图中(图2)，秸秆还田5个处理样本有11个门水平存在差异，除一些含量稀少的门外，Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)相对丰富较高。

横坐标(Sample name)是样品名；纵坐标(Relative abundance)表示相对丰度；Others表示最大相对丰度(某个门在所有样品中相对丰度的最大值)最高的10个门之外的所有门的相对丰度的和。

Name Sample (Horizontal coordinate) is the name of the sample; Relative abundance of vertical coordinates; Others represents maximum relative abundance(the maximum value of the relative abundance of a door in all samples).The highest relative abundance of all the doors outside the 10 gates.

图2 土壤细菌物种聚类OTU分析
Fig.2 Analysis of soil bacterial species cluster OTU

秸秆还田5个处理样本有效值进行比较分析，施肥处理显示数均大于对照，说明秸秆还田耕层土壤环境中细菌的差异种类数较高。秸秆还田与施氮肥处理下的土壤细菌群落的多样性有一定的变化。

2.5 不同施肥处理物种丰度聚类

选取最大相对丰度排名的前10个属所对应的OTUs系统发生关系数据，以及它们对应的OTUs的相对丰度信息，实现OTUs水平上的样品聚类(纵向聚类)，以此考察不同样品间的相似或差异性，展示结果见图3。

不同的施肥处理创造了不同的土壤环境，进而影响土壤细菌的数量以及不同处理间种类分布特征。CK处理的氨氧化古菌属(Candidatusnitrososphaera)、片球菌属(Pediococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)等丰度热度值较高，说明横向表示样品信息，纵向表示物种注释信息，位于左侧聚类树表示物种聚类；图上方表示样品聚类树；中间热图为Z值，表示已标准化处理后每行物种的相对丰度，即一个样品在某个分类上的Z值为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值。

Lateral representation of sample information，longitudinal representation of species annotation information，on the left side of the cluster tree indicates species clustering；Sample clustering tree；The middle image is Z，it is said to have been normalized for each species relative abundance，namely a sample in a classification on the Z value of the relative abundance of the sample in the classification and the difference in the average relative abundance of all the samples divided by the difference in the standard deviation of all the samples on the classification.

图3 细菌物种丰富度聚类图
Fig.3 The species richness of bacteria

这类产孢菌为CK处理特有菌类。M处理中深渊藤黄孢菌(Dokdonella)、单胞菌属(Luteimonas)、马赛菌属(Steroidobacter)等丰度热值较高，为M处理特有菌类。

WN、WCN、M、WC处理片球菌属(Pediococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)3种菌类丰度Z值较低，说明这3种菌类为CK处理特有的菌类。WCN处理的嗜酸菌属类(Candidatus-koribacter、Granulicella)丰度热度值值较高，为WCN处理特有菌类。WC处理为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)热度值较高。

2.6 样品复杂度分析

2.6.1 主成分分析 如图4所示，第一主成分贡献率达51.42%，第二主成分贡献率达20.17%，因子1和因子2代表总变量的71.59%。 以这2个主成分为坐标轴构建的二维坐标系中，各个处理在主成分分析图上分布差异显著，CK处理明显与其他处理分布位置不同，5组样本间的微生物组成存在差异，不同秸秆还田处理与对CK比都发生了明显的位置变化，显而易见，可以划分为3个大类，2季秸秆还田、有机肥处理较近，表明：秸秆还田处理土壤细菌群落的多样性与单施有机肥处理相似，1季秸秆还田加氮肥与最接近2季秸秆还田加氮肥处理，不同处理对土壤细菌群落结构的影响是不同的，2季秸秆还田加氮肥处理对土壤细菌群落结构的影响最大。在图4坐标系中，WCN处理与WC处理相距最远，这表明相同秸秆还田条件下，2季秸秆还田加氮肥与2季秸秆还田相比土壤细菌群落结构发生了变化，秸秆与化肥的作用效果不同，从而导致细菌群落的差异。

图4 基于门水平的的PCA分析结果展示Fig.4 PCA analysis based on the level of bacteria

2.6.2 样品聚类分析 在图5中，由在门水平上物种丰度统计结果所做的UPGMA聚类分析可以看出，不同处理之间细菌群落结构有明显的差异，各处理均有其优势门。

各处理变形杆菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)含量较高，为两大常见细菌类。CK处理泉古菌门(Crenarchaeota)距离较大。其中M处理变形杆菌门(Proteobacteria)相对丰度最大，并且WC处理细菌丰度分布与M处理相近。WN、WCN处理酸杆菌门(Acidobacteria)距离最大，说明其含量较为丰富，这表明秸秆降解以及追加的肥料(氮肥)对微生物的繁殖和生长具有一定的促进和诱导作用。

图5 细菌 UPGMA聚类分析Fig.5 Bacteria UPGMA clustering analysis

3 讨论与结论

秸秆结构是由半纤维素、木质素、纤维素等复杂的物质成分组成[17]，土壤需要大量酶、多种微生物及土壤细菌、真菌等联合作用才能充分降解施入土壤中的秸秆物料，从而促进了土壤中的养分循环。作物秸秆经过分解后，可为植物提供生长必需的营养元素，秸秆还田还可以增加有效养分含量及氮含量，提高土壤肥力，从而推动了该领域农业生产发展。

本试验运用秸秆还田与氮肥配施，结果表明两者配施较单施秸秆更有利于土壤有效养分的形成；秸秆还田与有机肥，结果表明，两者配施较单施秸秆物料更有利于提高土壤微生物群落的活性及物种丰富度。因此，秸秆还田必须结合有机肥和氮肥等化肥的施用方可发挥最大能量作用。

国外学者指出，微生物降解分解秸秆物料的过程发挥着重要的作用，有机和无机肥料可提供作物生长所必需的元素，作物根部器官生长旺盛，分泌物较多，相应地提高了根系的生理活性，使得土壤细菌更加活跃，显示出旺盛的生命力，进而改变了与根际效应关系密切的变形杆菌门(Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteria)等，促进了相对丰度的增加[18-21]。土壤环境中，土壤微生物量碳、氮等绝大部分来源于细菌[22]。在门水平上相对丰度中，变形杆菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、泉古菌门(Crenarchaeota)在秸秆还田后的土壤丰度较高，在对5个秸秆还田处理进行比较分析后表明，各秸秆还田施肥处理间细菌群落结构差异显著，其中秸秆和氮肥是影响细菌群落组成的主要因素。另外，从物种丰度聚类分析的结果中可以发现，在不同的施肥条件下，不同耕作处理和秸秆管理(化肥与有机肥、秸秆还田与不还田)对土壤细菌影响都有很大差异。

长期施肥(氮肥配施和秸秆还田)提高了土壤肥力和质量，改善了细菌生长的生境条件，细菌种群多样性明显高于不施肥(CK)处理。CK、WC、WCN、WN、M处理之间微生物的群落结构不同。土壤微生物数量和种类会受气候和土壤类型等影响，但后期秸秆和肥料对土壤细菌群落的影响也比较大，秸秆降解和添加肥料(氮肥料)对微生物的繁殖和生长有一定的效应，长期秸秆还田条件下，配施氮肥有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高，特别是可利用秸秆的土壤微生物的种群增加，有利于土壤生态环境的改善[23]。

本试验结果表明，化肥、秸秆能够显著的改变土壤的细菌数量，不同程度地促进或抑制土壤微生物数量的改变，加深对根际土壤生物活性的影响，尤其是有机肥能够促进根际细菌的繁殖[24-26]。随着长期施氮肥，土壤细菌群落为应对外界环境的变化自发的调整结构类型，同时显示出一定的稳定性[27-28]。由此可见，不同秸秆还田与施肥措施不仅改变了原土壤细菌群落的微环境，也影响了土壤细菌群落结构组成。其中秸秆还田细菌数量的增幅效果最大。

除CK外，WN、WCN、WC、M各个处理土壤中细菌的群落结构都具有较大的差异，其中2季秸秆还田+氮肥这2个因子对土壤细菌群落结构具有较大影响；通过多样性分析数据显示，长期秸秆还田及配施有机肥对土壤细菌群落多样性、丰富度及结构等也有一定的作用。

秸秆还田配施氮肥、单施有机肥均有利于提高土壤养分含量。秸秆还田的同时配施适量氮肥提高了植物根际和土壤中微生物活性，使植物秸秆更易分解，能快速转化成土壤中养分，从而在短时期内使作物增产。

秸秆还田与施肥能够不同程度地促进或抑制土壤细菌生长，以秸秆还田为主的施肥技术能够增加细菌活性，调节土壤细菌群落结构，提高土壤质量。

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Illumina Amplicon Sequencing of 16S rDNA Tag Reveals Bacteria Community Development of Long-term Straw Returning Soil

YUAN Mingzhang，LIU Shutang，CHEN Yanling，XIN Li，LIU Jintao

(Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

In order to explore the influence of the typical long term orientation of straw returning to field on soil microbial diversity and the relationship between soil microbial diversity and ecological environment effect, using 16S rDNA PCR sequencing technology,continuous 6 years of long term positioning of straw to field test,analysis of the composition of soil bacterial community structure.The results showed that soil microbial community diversity and species richness could be promoted after long-term fertilization of straw and organic fertilizer.The dominant species of bacteria in the soil after straw returning to field were the deformation of the Proteobacteria and Acidobacteria.Principal component analysis that significant differences in the types and contents of microorganisms among different treatments.WC and WCN treatment of N, P, K and other available nutrient content was significantly different.WCN treatment in the N, P, K and other available nutrients, organic carbon content and invertase, urease, cellulase activity was significantly higher than WC.The application of nitrogen fertilizer could significantly increase the soil nutrient content and enhance the soil enzyme activity, conducive to the improvement of soil is bacterial community diversity and stability, and improve the ecological environment of soil, so as to promote the increase of crop yield.

Straw returning；16S rDNA；Long-term experiment；Soil bacterial community

2017-07-12

山东省现代农业产业技术体系建设经费项目(SDAIT-01-022-06);鲁东丘陵区小麦玉米水肥自然资源高效利用综合技术集成与示范研究项目(2013BAD07B06-03);高效海洋复合微生物肥料关键技术的研究与示范(2015ZDXX0502B01)

袁铭章(1991-)，女，山东临沂人，在读硕士，主要从事植物营养与施肥技术研究。

刘树堂(1962-)，男，山东安丘人，教授，博士，主要从事植物营养与施肥技术研究。

S158

A

1000-7091(2016)06-0157-07

10.7668/hbnxb.2016.06.025