秦海霞，侯俊峰，丁会纳，夏先春，何中虎，Morris F Craig，王晨阳，马冬云

(1.河南农业大学 农学院，国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450002；2.中国农业科学院 作物科学研究所，国家小麦改良中心，北京 100081；3.美国农业部农业研究中心，西部小麦品质实验室，普尔曼 99164-6494)

Puroindoline b位点近等基因系对小麦籽粒淀粉含量
和组分及其特性的影响

秦海霞1，侯俊峰1，丁会纳1，夏先春2，何中虎2，Morris F Craig3，王晨阳1，马冬云1

(1.河南农业大学 农学院，国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州 450002；2.中国农业科学院 作物科学研究所，国家小麦改良中心，北京 100081；3.美国农业部农业研究中心，西部小麦品质实验室，普尔曼 99164-6494)

为了研究不同硬度等位基因与小麦籽粒淀粉组分含量及特性的关系，为小麦品质改良提供依据，以7个硬度Puroindoline b 位点近等基因系为试材，研究了不同硬度基因型对小麦籽粒淀粉组分含量及特性的影响。结果表明，Pina-D1b/Pinb-D1a基因型的籽粒硬度值、支链淀粉含量最高；Pina-D1b/Pinb-D1a基因型的淀粉溶解度最高，而Pina-D1a/Pinb-D1d溶解度最低，两者差异达显著水平；不同基因型之间籽粒淀粉酶解力没有显著差异；冻融失水率以基因型Pina-D1a/Pinb-D1b最低，表明Pina-D1a/Pinb-D1b基因型冻融稳定性最好，可能较适宜冷冻食品的制作；对于抗性淀粉，Pina-D1a/Pinb-D1b基因型的抗性淀粉含量最高、Pina-D1a/Pinb-D1d最低，表明Pina-D1a/Pinb-D1b基因型有助于籽粒中抗性淀粉含量的提高。

小麦；Puroindoline基因；近等基因系；淀粉特性；淀粉含量

籽粒硬度是最为重要的小麦(TriticumaestivumL.)品质性状之一，对整个小麦供应链(育种-磨粉-食品)均产生影响。根据胚乳质地，普通小麦可以分为硬质麦、混合麦和软质麦。硬质小麦磨粉后面粉中破损淀粉含量高、面粉具有较强的吸水能力，适合制作面包和优质面条等食品；而软质小麦面粉颗粒度较小、破损淀粉含量低、吸水能力较弱，适合于制作饼干、酥饼或蛋糕等粉质疏松类食品[1]。

小麦籽粒硬度反映的是胚乳中淀粉与蛋白结合的紧密程度，Greenwell等[2]认为，水洗淀粉表面的15 kDa的低分子质量蛋白(Friabilin)起一种类似“反黏合”的特性，它的存在削弱了淀粉与蛋白之间的结合。Friabilin蛋白的发现推进了籽粒硬度在分子水平上的研究进程，Puroindoline 蛋白是Friabilin 蛋白的主要成分，是形成小麦籽粒硬度的基础，主要由2种组分Puroindoline a(PINA) 和 Puroindoline b(PINB) 组成[3]。小麦品种籽粒硬度的差异是由Pina和Pinb基因的不同变异类型造成的，Pina不表达或Pinb基因序列发生突变均会导致小麦胚乳质地变硬[4]。在普通小麦中已发现多种 Puroindoline 基因的变异类型[5-7]。淀粉是小麦籽粒中主要成分，约占小麦籽粒重量的80%左右，不同品种淀粉含量、组分及其淀粉特性的差异影响其面食制作品质及淀粉的应用。赵新等[8]研究表明，籽粒硬度值升高，则籽粒中淀粉含量下降；而淀粉组分则表现为直链淀粉所占比重下降，而支链淀粉含量上升。Brites等[9]对4种Puroindoline 基因等位变异的品种分析表明，Pina-D1a/Pinb-D1d基因型的直链淀粉含量最高，但与Pina-D1a/Pinb-D1b和Pina-D1b/Pinb-D1a基因型之间并没有显著差异，仅与Pina-D1a/Pinb-D1a之间差异达显著水平。王琳[10]认为抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈极显著正相关，与总淀粉含量呈显著正相关。然而已有研究主要采用不同遗传背景的小麦品种试材，其结果具有较大的局限性。本研究以遗传背景相同的7个近等基因系试材，研究不同硬度基因对小麦籽粒淀粉组分含量及特性的影响，旨在为小麦品质改良提供理论指导依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1套Puroindoline b 位点等位变异的7个近等基因系，分别为Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1a/Pinb-D1b、Pina-D1a/Pinb-D1c、Pina-D1a/Pinb-D1d、Pina-D1a/Pinb-D1e、Pina-D1a/Pinb-D1f和Pina-D1a/Pinb-D1g。近等基因系材料由美国USDA-ARS小麦品质实验室提供。试材于2014年分别种植于河南农业大学科教示范园区，每个材料播种3行，小区长2 m，重复3次，播种量11 g/m2，田间管理按当地常规方法进行，小麦籽粒成熟期采用人工收获、脱粒。籽粒贮藏60 d后进行品质测试分析。

1.2 试验方法

1.2.1 磨粉 采用 4100 型单籽粒硬度仪(SKCS，PERTEN，瑞典)测定小麦籽粒硬度。采用旋风磨FOSS CyclotecTM1093小麦磨粉。

1.2.2 抗性淀粉含量的测定 抗性淀粉含量的测定参考王琳等[11]方法略做改进。称取100 mg(±5 mg)样品于离心管中，向离心管中加入200 μL蒸馏水，100 ℃煮20 min，保温10 min。然后加入KCl-HCl缓冲液，用玻璃棒捣碎，再加入100 μL胃蛋白酶，37 ℃消化1 h。向离心管中加入4 mL马来酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH值6.0)，4 mL胰α-淀粉酶酶液，NaOH调pH值至6.9。在37 ℃水浴振荡消化16 h。然后离心(4 000 r/min，15 min)，弃上清，沉淀用50%的乙醇溶液洗涤，离心，重复2次。然后加入2 mL 2 mol/L KOH溶液，室温下振荡(注意不要在旋转混合器上混匀以防止淀粉乳化)。向离心管中加入8 mL醋酸钠缓冲液(1.2 mol/L，pH值3.8)，再加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶酶液(3 300 U/mL)孵育，混匀，60 ℃水浴1 h。将离心管取出，冷却至室温，混匀，离心。取0.15 μL上清于相对应的试管中，向其中加入1.5 mL GOD-PAP试剂，轻轻混匀，37 ℃水浴7 min；另取2支试管，1个加入0.15 μL醋酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH值4.5)代替样品做空白，1个加入0.15 μL葡萄糖试剂盒标准液(标准葡萄糖浓度1 mg/mL)，再向2个管中各加入1.5 mL GOD-PAP试剂，轻轻混匀，37 ℃水浴7 min。采用分光光度计510 nm测吸光度，测定葡萄糖含量。

抗性淀粉含量：RS=A(样品)/A(标准葡萄糖)×0.9×10.3/W×100%

其中，0.9为淀粉与葡萄糖的转换系数；10.3为溶液总体积；W为样品干质量。

1.2.3 淀粉含量及组分的测定 总淀粉含量的测定参照 《GB/T20378-2006 原淀粉 淀粉含量测定旋光法》，样品过0.25 mm孔径筛，称2.5 g，置于100 mL三角瓶中，加入25 mL 0.32 mol/L盐酸溶液，沸水浴加热，沸腾10 min。迅速冷却至室温，移入50 mL容量瓶，加3 mL 30%硫酸锌，摇匀后加3 mL 15%亚铁氰化钾，用蒸馏水定容，静置，过滤(弃初滤液)。蒸馏水调零，测定旋光度。淀粉(%)=α×50/[LW(100-H)×203]×100%(α为在旋光仪上读出的旋转角度；L为旋光管长度(dm)；W为样品质量(g)；203为淀粉比旋度；H为样品水分含量)。

籽粒中直链淀粉含量测定参考金玉红等[12]，采用双波长法，其中直链淀粉采用波长为540，730 nm。支链淀粉含量为总淀粉含量减去直链淀粉含量。

1.2.4 小麦淀粉酶解力和溶解度与膨胀度及冻融稳定性的测定 淀粉酶解力的测定参考赵思明等[13]的方法，取0.2 g的样品，加20 mL蒸馏水，5%的淀粉酶2 mL，于39 ℃下振荡90 min，加入1 mol/L HCl 1 mL，定容到50 mL，摇匀后过滤。滤液稀释6倍，取1 mL稀释液和1 mL DNS试剂于50 mL比色管中，沸水浴5 min，快速冷却，加10 mL蒸馏水，于540 nm下比色(以不加淀粉样品的空白调节零点，其他处理相同)，以每克淀粉的吸光值作为酶解力。

溶解度与膨胀度测定参考侯蕾等[14]的方法略作修改，在80 ℃水浴加热并搅拌2.0%(m/m)淀粉乳30 min，再以3 000 r/min离心20 min，分离上层清液，烘干称重为水溶淀粉质量，下层为膨胀淀粉部分。溶解度=水溶淀粉质量/淀粉样品质量×100%；膨胀度=膨胀淀粉质量/(淀粉样品质量×(100-溶解度))×100%。

冻融稳定性测定参考侯蕾等[14]略作修改，将面粉加水配制成6%的悬浮液，置于水浴中加热至95 ℃，使其充分糊化。取出样品冷却至室温，将其放入-18 ℃的冰箱中冻藏24 h，随后自然解冻，重复3次冻融处理，观察淀粉糊变化情况。冻融失水率=冻融后胶体的析水量(g)/胶体原来的总质量(g)×100%。

1.3 数据分析

利用 Excel进行数据的整理及作图，采用SPSS 17.0版进行数据统计与差异性分析。

2 结果与分析

2.1 Puroindoline b位点等位变异对小麦籽粒淀粉含量及其组分的影响

由表1可见，Pina-D1b/Pinb-D1a基因型的籽粒硬度最高，Pina-D1a/Pinb-D1d基因型籽粒硬度最低，且Pina-D1b/Pnb-D1a、Pina-D1a/Pinb-D1c、Pina-D1a/Pinb-D1d和Pina-D1a/Pinb-D1f基因型间差异达显著水平。总淀粉含量以Pina-D1a/Pinb-D1e最低，与其他基因型间差异均达显著水平(Pina-D1a/Pinb-D1c和Pina-D1a/Pinb-D1f除外)。直链淀粉含量以Pina-D1a/Pinb-D1f最高，但仅与Pina-D1b/Pinb-D1a基因型间差异达显著水平。支链淀粉含量以Pina-D1a/Pinb-D1e基因型最低，且与Pina-D1b/Pinb-D1a、Pina-D1b/Pinb-D1b、Pina-D1b/Pinb-D1d基因型间差异达显著水平。直链淀粉含量与支链淀粉含量的比值对面食品质的影响较大，表1结果表明Pina-D1a/Pinb-D1f基因型直/支最高，且仅与Pina-D1b/Pinb-D1a基因型之间的差异达显著水平。

表1 不同硬度基因型小麦籽粒淀粉及其组分含量Tab.1 Comparison of wheat starch component content among seven NILs

注：数据后不同字母表示 5%显著差异。表2同。

Note：Means followed by different letters are significantly different atP<0.05.The same as Tab.2.

2.2 Puroindoline b位点等位变异对小麦籽粒抗性淀粉含量的影响

从图1可见，基因型Pina-D1b/Pinb-D1d抗性淀粉含量最低，但仅与Pina-D1a/Pinb-D1b、Pina-D1a/Pinb-D1c和Pina-D1a/Pinb-D1g之间差异达显著水平。基因型Pina-D1a/Pinb-D1b抗性淀粉含量最高，与其他基因型之间差异均达显著水平，且是最低含量的2.43倍；表明含有这种硬度基因型的小麦品种可能有助于籽粒中抗性淀粉含量的提高。

2.3 Puroindoline b位点等位变异对小麦籽粒淀粉特性的影响

由表2可知，溶解度以基因型Pina-D1b/Pinb-D1a最高，Pina-D1a/Pinb-D1d最低，且2个基因型间差异达显著水平。膨胀度以Pina-D1a/Pinb-D1g最低，且与其他基因型之间差异均达显著水平。

柱上的不同字母表示Puroindoline b位点近等基因系间差异显著，P<0.05。Different letters on the column meant significant difference at 50% probablity.

淀粉冻融失水率反映淀粉的冻融稳定性。由表2数据可知，冻融失水率以基因型Pina-D1a/Pinb-D1b最低，且与其他基因型间差异达显著水平(Pina-D1a/Pinb-D1c除外)。冻融失水率低，则冻融稳定性好，适宜做冷冻食品。酶解力在不同Puroindoline b 位点等位变异之间没有显著差异，这也表明本试验所用的硬度等位变异基因型差异对淀粉酶解力没有显著影响。

3 讨论与结论

不同籽粒硬度对小麦淀粉组分含量及特性有重要影响，张春庆等[15]对33个普通小麦的19个品质性状间的相关性分析，则表明直链淀粉含量与籽粒硬度之间呈极显著正相关；而胡瑞波等[16]通过对16个不同品种的山东小麦主要品质性状与淀粉含量的相关性分析，表明籽粒硬度与淀粉含量呈显著负相关，与直链淀粉含量呈负相关；研究结果的差异可能与所采用的研究样本有关。本研究采用遗传背景相同，硬度基因不同的等位变异近等基因系为试验材料，结果表明基因型Pina-D1b/Pinb-D1a籽粒硬度最高，直链淀粉含量最低，这与胡瑞波等研究结果一致。研究认为直链淀粉含量较低的小麦品种具有较好的面条品质[17-19]。本研究中Pina-D1b/Pinb-D1a基因型的直链淀粉含量最低，Pina-D1a/Pinb-D1f基因型直链淀粉含量最高，从淀粉组分而言Pina-D1a/Pinb-D1f基因型的面条制作品质较差，这与已有研究结果部分一致[20]。而已有研究表明Pina-D1b/Pinb-D1a和Pina-D1a/Pinb-D1f基因型的面条感官评价值均较低，这可能与面条评价不仅与淀粉组分有关，还与淀粉糊化特性及其他成分含量有关。

表2 不同硬度基因型小麦籽粒淀粉特性比较Tab.2 Comparison of wheat characteristics among seven NILs

抗性淀粉能抵抗淀粉酶的消化作用，和不消化的低聚糖以及非淀粉多糖有很多的相似之处，具有膳食纤维相似的作用，有助于预防糖尿病、控制体重[21-22]。游倩倩等[23]认为直链淀粉含量较高的品种，更容易得到较高的抗性淀粉。本研究结果表明，Pina-D1a/Pinb-D1f基因型的直链淀粉含量最高，但其抗性淀粉含量并未达到最高值；基因型Pina-D1a/Pinb-D1b的抗性淀粉含量最高，而其直链淀粉含量与Pina-D1a/Pinb-D1f基因型之间并未达显著水平。这主要与试验所用材料有关，本研究所用材料遗传背景相同，抗性淀粉含量差异主要来源于不同硬度等位变异，而已有的研究中抗性淀粉含量的差异除了硬度等位变异，可能还与其他因素有关。同时，本研究结果表明Pina-D1a/Pinb-D1b基因型抗性淀粉含量最高，而Pina-D1a/Pinb-D1d抗性淀粉含量最低，因此，在小麦品种选育时，根据目标性状选择不同基因型有助于提高专用小麦品质。

溶解度和膨胀度代表淀粉的持水能力，冻融失水率反映了淀粉冻融稳定性，失水率越高，稳定性越差。本研究中7个不同Puroindoline b位点等位变异在酶解力方面没有显著差异。溶解度表现为Pina-D1b/Pinb-D1a基因型最高，Pina-D1a/Pinb-D1d基因型最低，表明Pina-D1a/Pinb-D1d基因型持水能力较差。冻融失水率以Pina-D1a/Pinb-D1b基因型最低，表明基因型Pina-D1a/Pinb-D1b稳定性最好，适合做冷冻食品。因此，进一步研究不同基因型品种对小麦淀粉品质尤其是在食品制作或其他工业方面的影响，可为专用小麦选育提供参考。

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Starch Content and Properties of Common Wheat in Near-isogenic Lines of Puroindoline b Alleles

QIN Haixia1，HOU Junfeng1，DING Huina1，XIA Xianchun2，HE Zhonghu2，Morris F Craig3，WANG Chenyang1，MA Dongyun1

(1.Agronomy College of Henan Agricultural University，National Engineering Research Center for Wheat，Zhengzhou 450002；2.Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Wheat Improvement Center，Beijing 100081，China； 3.USDA-ARS，Western Wheat Quality Laboratory， Pullman WA99164-6494， USA)

Understanding the effect of Puroindoline b (Pinb) alleles on wheat grain starch content and properties will lay the foundation for improving the wheat quality.Seven wheat near-isogenic lines (NILs) differing in Puroindoline b were used to compare their grain starch component content and properties.The results showed thatPina-D1b/Pinb-D1agenotype possessed significantly higher values of grain hardness and amylopectin content than other genotypes.ThePina-D1b/Pinb-D1agenotype possessed the highest starch solubility，and thePina-D1a/Pinb-D1dgenotype had the lowest value，their difference being significant.There was no significant difference in starch enzymolysis force between different genotypes.ThePina-D1a/Pinb-D1bgenotype had the lowest freezing and thawing loss rate，indicating thatPina-D1a/Pinb-D1bgenotype possessed better freeze-thaw stability and would suit for making frozen food.For resistant starch，thePina-D1a/Pinb-D1bgenotype possessed the highest resistant starch content，while the lowest value went toPina-D1a/Pinb-D1d，which suggested thatPina-D1a/Pinb-D1bgenotype contributes to high resistant starch content of grains.

Wheat；Puroindoline gene；Near-isogenic lines；Starch properties；Starch content

2016-06-02

国家自然科学基金项目(31571651)；省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室自主课题(39990035)

秦海霞(1990-)，女，河南洛阳人，硕士，主要从事小麦品质生理研究。

马冬云(1972-)，女，河南修武人，副研究员，博士，硕士生导师，主要从事小麦高产优质栽培生理研究。

S512.1；S311

A

1000-7091(2016)06-0039-05

10.7668/hbnxb.2016.06.007