霍爱华，孙雪荣，于文慧，李华涛，李 乐，李洪才，田文儒

(青岛农业大学 动物科技学院，山东 青岛 266109)

热应激诱导猪肾小管上皮(LLC-PK1)细胞线粒体凋亡相关因子的时效表达

霍爱华，孙雪荣，于文慧，李华涛，李 乐，李洪才，田文儒

(青岛农业大学 动物科技学院，山东 青岛 266109)

拟探讨热应激诱导LLC-PK1细胞线粒体凋亡相关因子的表达和活性情况，以及激活线粒体凋亡通路的时间。采用qRT-PCR方法和Caspase活性检测试剂盒分别检测42 ℃热应激处理后0，2，4，8，16 h以及37 ℃培养的LLC-PK1细胞中HSP72、Bcl-2、Bax、AIF和Cyt.c的基因表达以及Caspase-9和Caspase-3的活性。结果显示，42 ℃热应激1 h，LLC-PK1细胞Bcl-2/Bax(P<0.05)和AIF(P<0.01)基因表达以及 Caspase-3(P<0.01)活性从0 h开始升高(P<0.01)，到2 h达到最高(P<0.01)；HSP72基因表达和Caspase-9活性0 h即达到最高(P<0.01)；Cyt.c基因表达在2 h开始极显著升高(P<0.01)，并且此时最高，8 h以后全部因子恢复到正常水平。结果表明，42 ℃热应激1 h即激活LLC-PK1细胞线粒体凋亡通路，且热应激后的0～8 h线粒体凋亡通路处于活化状态，其中2 h时最为活跃。

热应激；猪肾小管上皮细胞；线粒体凋亡

地球温度在升高，人类正面临高温的影响。已经证明，高温使动物产生热应激反应，降低繁殖力和生产力。研究表明，热应激可诱导细胞凋亡[1]，引起猪肾小管上皮细胞损伤[2-3]。线粒体凋亡通路是细胞凋亡的主要通路之一。线粒体凋亡通路中，凋亡信号诱导线粒体释放细胞色素C(Cyt.c)和AIF等凋亡诱导因子，线粒体Cyt.c在电子传递链中扮演传递电子的角色，而释放到细胞质中后，与Apaf-1结合活化Caspase-9，激活的Caspase-9可以切割并激活Caspase-3，导致细胞凋亡[4]；从线粒体中释放出的AIF则转移至细胞核，切割DNA，诱导细胞凋亡[5]。而热休克蛋白(HSPs)对热应激反应极其敏感，起到保护细胞的作用，其中HSP72对热应激反应最为敏感[6]，是细胞受到应激刺激而合成的1组高度保守的蛋白。研究表明，HSP72能提高细胞的热耐受性[7]，抑制线粒体上游和下游的凋亡因子活性[8]，保护线粒体[9]。研究证明，凋亡细胞线粒体膜通透性发生改变，导致跨膜电位下降[10]，而Bcl-2家族在细胞凋亡中起着关键作用，其中Bax为促凋亡主要的蛋白，作用于细胞线粒体膜上，促进线粒体跨膜通道的开放，改变线粒体通透性，进而促进Cyt.c和AIF等促凋亡蛋白的释放；Bcl-2是Bcl-2家族中主要的抑制凋亡蛋白，主要分布于线粒体膜和内质网膜等，起到抑制Bax的促凋亡的作用[11]。Bcl-2蛋白家族可以调控线粒体通透性转换孔(MPTP)的开闭，同时热应激时诱导细胞线粒体内的Ca2+超载，ROS增加，能量衰竭等也影响MPTP的开闭[12]。因此，研究热应激诱导的线粒体凋亡相关因子的表达以及活性情况，有利于深入理解细胞凋亡的机理，并可为降低热应激诱导的细胞凋亡、缓解动物的热应激反应，提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Thermo公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，青霉素与链霉素混合液(100×)购自Solarbio公司；RNA提取试剂盒购自Aidlab Biotech公司，反转录试剂盒购自Thermo 公司，LighCycler®480 SYBR Green I Master 购自Roche公司；Caspase-9 和Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞系及其培养

猪肾小管上皮细胞系(LLC-PK1)购自美国ATCC公司，购买时为3代细胞系。用高糖 DMEM 培养液+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液(100×)，在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁达80%～90%时，进行胰酶消化传代。

1.3 线粒体凋亡相关基因时效表达的检测

猪肾小管上皮细胞进行42 ℃热应激1 h，分别于热应激处理后0，2，4，8，16 h后提取热应激处理细胞以及37 ℃培养细胞(作为对照组)的总RNA，并按照RNA反转录试剂盒说明进行反转录，反转录体系为20 μL：提取的RNA 7 μL，随机引物(0.2 μg/μL) 1 μL，DEPC水4 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，Ri-bolockTMRNase Inhibitor 1 μL；10 mmol/L dNTP Mix 2 μL；反转录酶(RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase)1 μL，反转录条件为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min。反转录后，使用灭菌双蒸水稀释到90 μg/mL，然后用Roche Ligh Cycler480Ⅱ荧光定量PCR仪进行检测，其反应体系(10 μL)为：cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL，LighCycler®480 SYBR Green I Master 5 μL，引物上游0.2 μL、下游0.2 μL。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。qRT-PCR 反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共 45个循环。各组以β-action基因为内参，采用2-ΔΔCt进行相对定量分析[13]。

表1 引物列表Tab.1 Primer sequences for the qRT-PCR assay

注：HSP72.热休克蛋白72基因；Bcl-2.B细胞淋巴瘤/白血病-2基因；Bax.B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白基因；Cyt.c.细胞色素C基因；AIF.促凋亡蛋白基因；β-action.β-肌动蛋白基因。

Note：HSP72 .Heat shock protein 72 gene；Bcl-2.B-cellymphoma/leukemia-2 gene；Bax.Bcl-2 associated X protein gene；Cyt.c.Cytochrome c gene；AIF.Apoptosis inducing factor gene；β-action.β-non-muscle actin gene.

1.4 Caspase-9和Caspase-3活性检测

参照Caspase活性检测试剂盒说明书进行检测，首先测定酶产物标准曲线，将酶产物标准品稀释为0，10，20，50，100，200 μmol/L，作为标准品，分光光度分别检测A405下的吸光值，制作标准曲线。然后将42 ℃热应激1 h的猪肾小管上皮细胞分别于热应激处理后0，2，4，8，16 h热应激组以及37 ℃培养的对照组用胰酶收集至细胞培养液中，以2 557 r/min离心5 min，PBS洗涤一次，加入裂解液进行冰浴裂解15 min，在4 ℃条件下，以13 210 r/min离心10 min，收集上清，进行Caspase活性以及蛋白浓度测定。Caspase酶活性反应体系为检测缓冲液50 μL+样品40 μL+底物10 μL。37 ℃孵育1 h，用微量分光光度计在A405nm处测定。蛋白浓度用Bradford方法检测。计算出每毫克蛋白中含多少酶活力单位(一个酶活力单位为底物饱和时在37 ℃ 1 h内剪切1 nm底物产生1 nm产物Caspase的酶量)。

1.5 统计分析

数据使用Graph Pad Prism 5 进行统计学处理，LSD多重比较分析，均值间进行t检验。

2 结果与分析

2.1 热应激诱导的LLC-PK1细胞HSP72、Bcl-2和Bax基因的时效表达

qRT-PCR检测结果(图1)显示，42 ℃热应激1 h处理猪肾小管上皮细胞，HSP72 mRNA迅速转录，与37 ℃对照组相比极显著增高(P<0.01)，且在热应激后立即达到最高点，随后逐渐下降，在0～2 h内下降迅速，2～4 h内下降缓慢，8 h后趋于平稳与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。Bcl-2热应激后0～16 h内mRNA的表达量先升高后降低，在2 h时表达量最高，极显著高于对照组(P<0.01)，随后逐渐下降，4 h后表达量与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)；BaxmRNA表达趋势与Bcl-2 相反，在0～16 h内先降低后升高而后趋于对照组表达量，在2 h表达量最低，显著低于对照组(P<0.05)，8 h表达量最高，显著高于对照组(P<0.05)；Bcl-2/Bax表达曲线显示在0～16 h内，其比值先升高后降低，2 h时最高，极显著高于对照组(P<0.01)，4～16 h内与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。

*.与对照组相比差异显著(P<0.05)；**.与对照组相比差异极显著(P<0.01)。图2-3同。*.Significant difference compared to control(P<0.05)；**.Extremely significant difference compared to control(P<0.01).The same as Fig.2-3.

2.2 热应激诱导的LLC-PK1细胞Cyt.c和AIF基因的时效表达

qRT-PCR检测结果(图2)表明，热应激后16 h内，AIF和Cyt.cmRNA表达量逐渐增高，2 h后开始降低。其中0，2 hAIF表达量极显著高于对照组(P<0.01)，4 h后趋于平稳，与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；Cyt.c的表达量在2，4 h时极显著高于对照组(P<0.01)，8 h的表达量略高于对照组但与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)，16 h的表达量亦与对照组相比没有显著差异(P>0.05)，且2 h后Cyt.c的表达量一直是降低趋势，直到16 h。

图2 各组细胞中AIF和Cyt.c mRNA表达Fig.2 Heat stress induces the production of AIF and Cyt.c mRNA in LLC-PK1 cells

2.3 热应激诱导的LLC-PK1细胞Caspase-9和Caspase-3活性

Caspase活性检测结果表明(图3)，热应激处理后的16 h内，Caspase-9的活性在热应激刚刚结束后最高，且极显著高于对照组(P<0.01)；而后逐渐降低，8 h后其活性逐渐恢复到平稳，与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。Caspase-3的活性也是先升高后降低。在2 h处活性最高，极显著高于对照组(P<0.01)，而后逐渐降低，其中0～4 h活性仍然极显著高于对照组(P<0.01)，8 h以后与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。

图3 各组细胞中Caspase-9和Caspase-3活性检测Fig.3 Heat stress induces the activity of Caspase-9 and Caspase-3 in LLC-PK1 cells

3 讨论

HSPs是在受热或其他理化以及生物等刺激后发生应激反应而产生的一类蛋白。其中HSP70家族的成员最为保守，广泛分布于细胞的各个部分[14]。其中HSP72在正常细胞中不表达或者很少表达，但在热应激条件下可以迅速表达。HSP72参与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解，能帮助新生肽正确折叠以及修正或降解错误的蛋白，以维持细胞的正常结构和功能，增强细胞的耐受性，保护细胞[15]。另一方面，HSP72也通过抗细胞凋亡作用，增强细胞的耐受性。研究表明，HSP72经线粒体通路抗细胞凋亡，HSP72可抑制Cyt.c的释放以及其与Apaf-1结合，阻止Caspase-9前体募集到Apaf-1，从而抑制Caspase-9的激活[16]；Garg等[17]研究表明，HSP72阻止Bax转移到线粒体上，维持线粒体膜的通透性，抑制凋亡因子AIF和Cyt.c等的释放，从而抑制线粒体凋亡通路。HSP72在细胞应激中扮演着重要角色，本研究表明，42 ℃热应激1 h后LLC-PK1细胞HSP72 mRNA迅速表达，并立即达到最高点，而后逐渐下降。可能是由于胞质中HSP72基因没有内含子，可以迅速大量转录出HSP72 mRNA[18]；而且，HSP72基因的转录主要受热休克因子HSF调控、启动迅速，当热应激反应时，HSF磷酸化，形成有活性的三聚体，转入核内，在核内与热休克基因上游启动子区域HSE序列结合，并进一步被激酶磷酸化，启动热休克基因的表达，这个过程迅速快捷，在受热后数分钟便可达到最高水平[19]。邱定杰[20]研究在不同的热应激持续时间中，肝脏HSP72 mRNA的转录量急剧升高，至1 h达到峰值，与本试验结果基本一致。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起着重要作用，线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用，而有研究表明，Bcl-2家族蛋白的主要作用位点就在线粒体膜上[21-22]。Bcl-2家族的大部分抗凋亡蛋白一般作为细胞器膜(如线粒体、内质网和核膜)的整合膜蛋白被隔离起来，而促凋亡蛋白则以非活性的形式定位分布于胞液中或细胞质骨架上。其中Bax是主要的促凋亡因子，当细胞受一定刺激时，其转移到线粒体等膜上，使线粒体膜的通透性增强，释放凋亡因子AIF和Cyt.c等，激活线粒体凋亡通路；而抑制凋亡蛋白Bcl-2与Bax结合形成异二聚体，从而拮抗Bax的抗凋亡作用。Scopa等[23]、Oshikawa等[24]以及Adhya等[25]研究发现，Bcl-2/Bax可作为预测肿瘤或者癌症临床治疗疗效的标志物。本试验结果显示热应激处理后，Bcl-2先升高后降低，在2 h处最高；而Bax先降低后升高，2 h最低，Bcl-2/Bax比值升高表示其发挥抗凋亡的作用，而非促进凋亡。而热应激处理后，AIF和Cyt.c基因表达增高，也是在2 h处达到最高，其次Caspase-9和Caspase-3也不同程度的增高，因此，42 ℃热应激1 h处理猪肾小管上皮细胞其线粒体凋亡通路被激活。因此猜测，其线粒体通路激活是由其他因素导致的，不是Bax引起的。Bcl-2家族中Bad也能与Bcl-2形成异二聚体，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用；Wei等[26]、Kataoka等[27]研究发现，被激活的tBid和Bcl-rambo也能引起线粒体膜通透性的改变，促进Cyt.c等的释放，诱发细胞凋亡。同时，线粒体膜通透性的改变也受到活性氧增加、Ca2+超载和能量衰竭等多种因素的影响。

线粒体凋亡过程中，促凋亡蛋白从线粒体的释放至关重要[28]，一旦释放促凋亡蛋白(Cyt.c、AIF)，激活Capsase-9和Caspase-3等，级联放大凋亡信号，导致蛋白降解，DNA切割，诱导细胞凋亡。Caspase不仅是细胞凋亡的执行者，还可以激活第二信使，修饰Bcl-2(将Bcl-2转变为促凋亡的Bax样因子)，改变细胞内氧化还原水平，过表达Bax和Bak等促凋亡因子，再作用于线粒体，实现凋亡信号的放大，加快凋亡进程。这也可能是本研究中，Caspase-9的表达首先达到最高点，而后AIF和Cyt.c等随后达到最高点的原因。

本研究从分子水平揭示了热应激诱导LLC-PK1细胞线粒体凋亡通路相关因子基因以及相关活性的时效表达情况，但是细胞凋亡的调控过程精密而又错综复杂，需要进一步研究。

42 ℃热应激1 h即激活LLC-PK1细胞线粒体凋亡通路，且热应激后的0～8 h线粒体凋亡通路处于活化状态，其中2 h时最为活跃。

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Expression of Factors Related to Mitochondrial Apoptosis in Pig Kidney Proximal Tubular (LLC-PK1) Cells Induced by Heat Stress

HUO Aihua，SUN Xuerong，YU Wenhui，LI Huatao，LI Le，LI Hongcai，TIAN Wenru

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China)

To investigate the expression and the activity of factors related to mitochondrial apoptosis in LLC-PK1 cells induced by heat stress，and the time of activation of mitochondrial apoptotic pathway，we assessed theHSP72，Bcl-2，Bax，AIF，Cyt.cexpressions in LLC-PK1 cells by qRT-PCR and Caspase-9，Caspase-3 activity by caspase activity assay kit at 0，2，4，8，16 h after 42 ℃ heat stress treatment for 1 h.The above factors were also measured in cells cultured at 37 ℃ as control.Results demonstrated thatBcl-2/BaxandAIFgene expressions and Caspase-3 activity significantly increased from 0 h，and reached the highest point at 2 h after heat stress；HSP72 gene expression and Caspase-9 activity reached the highest point at 0 h；Cyt.cgene expression significantly increased and reached the highest point at 2 h，and all the measured factors returned to normal level at 8 h after heat stress.The above results reveal that mitochondrial apoptotic pathway in LLC-PK1 cells is in a state of activation in 0-8 h after 42 ℃ heat stress for 1 h and is the most active at 2 h.

Heat stress；LLC-PK1 cells；Mitochondrial apoptosis

2016-04-15

国家自然科学基金项目(31572590；31502138)；山东省自然科学基金项目(BS2015NY001)

霍爱华(1987-)，女，山东菏泽人，硕士，主要从事动物生殖生理与疾病研究。

田文儒(1959-)，男，黑龙江兰西人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物生殖生理与疾病研究。

Q78

A

1000-7091(2016)06-0094-06

10.7668/hbnxb.2016.06.015