李海燕 张欢欢 杨彦平 李荣荣

(陕西省核工业二一五医院老年科，陕西 咸阳 712000)

谷胱甘肽S-转移酶M1基因多态性与糖尿病相关性研究

李海燕 张欢欢 杨彦平 李荣荣

(陕西省核工业二一五医院老年科，陕西 咸阳 712000)

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶M1基因(GSTM1)多态性与糖尿病的相关性。方法 采用聚合酶链反应(PCR)的方法对正常健康对照组(n=110)与糖尿病组(n=112)GSTM1基因型进行检测。结果 糖尿病组GSTM1缺失率(72.32%)明显高于正常对照组(35.45%)，两者差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论 GSTM1基因多态性与糖尿病存在相关性，GSTM1基因缺失型可能是糖尿病高危易感因素。

糖尿病； 谷胱甘肽S-转移酶M1基因； 遗传多态性

GSTM1基因位于染色体1p13.3，其包括缺失型GSTM1-0以及无意义突变型GSTM1-a和GSTM1-b[1]。氧化应激被认为在糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病病理发展过程中起着重要的作用[2]。谷胱甘肽S-转移酶为机体内最重要的抗氧化损伤的系统，GST基因的多态性可能会降低酶的抗氧化活性，从而易患糖尿病[3]。然而，目前罕有对GST基因多态性与中国人群糖尿病患者相关性的研究报道。本研究旨在初步探讨咸阳地区糖尿病患者与GSTM1基因多态性相关性,报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 糖尿病组：选择2013年1月至2015年3月来我院就诊的Ⅱ型糖尿病患者112例，男性61例，女性51例，所有患者均无心脑血管疾病、神经系统疾病、肾功能不全及高血压病史。平均年龄(47 ± 10.21)岁。对照组：来自正常健康志愿者110名，男性53名，女性47名，平均年龄(48 ± 9.07)岁，所有对照组均无动脉粥样硬化、肿瘤、糖尿病及高血压病史。对照组及糖尿病组在年龄及体质量指数相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂及仪器 全血基因组提取试剂盒购自美国Axygen biosciences公司；2×PCR Mixture 购自立陶宛MBI公司；Biomltra梯度PCR仪为德国Sigma公司产品；WD29403c型紫外透视仪为北京六一仪器厂产品。

1.3 引物设计和合成 根据GSTM1基因序列，采用prime5软件设计PCR扩增引物：P1 5’-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3’，P2 5’-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3’，扩增产物长度215 bp；并以β-actin为内参照。引物序列为：P1 5’-ACT CCC CAT CCC AAG ACC-3’, P2 5’-CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3’, 扩增产物长度为400 bp，引物由上海生物工程公司合成。

1.4 外周血标本采集和基因组DNA提取 采取所有研究对象外周静脉血3 mL，并以乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为抗凝剂，放置于-20 ℃低温冰箱备用。基因组DNA提取按照外周血微量基因组DNA提取试剂盒说明书操作，所提取DNA放置于-20 ℃低温冰箱备用。

1.5 GSTM1基因型PCR扩增 采用Biomltra梯度PCR仪对所有DNA标本进行GSTM1基因型检测。反应体系为25μL(2×PCR Mixture 12.5μL，双蒸水8.5μL，各引物量为0.5μL，浓度1.0μmol/L，DNA模板2μL，浓度为100μg/μL)。反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环，72 ℃延伸7 min。

1.6 电泳检测 PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，WD29403c型紫外透视仪观察结果后照相。GSTM1基因型检测结果以能扩增出215 bp片断为GSTM1(+)，否则为GSTM1(-)，并可见扩增产物为400 bp的β-actin，所有样本均重复3次PCR扩增及电泳检测。

2 结 果

2.1 GSTM1基因型检测结果 正常对照组，GSTM1基因缺失型样本PCR扩增产物电泳只能见400 bp β-actin产物；糖尿病组可见215 bp GSTM1基因扩增产物及400 bp β-actin产物。见图1。

注：M 50bp Marker；泳道1, 3, 4, 6 为GSTM1(-)；泳道2, 5 为GSTM1 (+)图1 GSTM1基因型PCR扩增产物电泳图。

2.2 GSTM1基因型在正常对照组及糖尿病组的分布 采用Hardy-Weinberg(HWE)方法对GSTM1基因多态性分布进行遗传平衡检验后发现P均>0.05，符合遗传平衡定律。GSTM1基因缺失型在糖尿病组检出率(72.32%)高于对照组检出率(35.45%)(P<0.001)。见表1。

表1 正常对照组与糖尿病组GSTM1基因型

注：与对照组相比较，*χ2=30.371，P<0.01。

2.3 GSTM1基因型与糖尿病相关性

经GSTM1基因缺失型与糖尿病相关性统计分析发现，GSTM1基因缺失型糖尿病患者较对照组相比较OR值为4.757，P<0.01。表明GSTM1基因缺失型可能是糖尿病高危易感因素。见表2。

表2 GSTM1(-)基因型与糖尿病相关性

3 讨 论

糖尿病的发生发展与机体内活性氧水平增加及抗氧化能力减弱有密切的相关性，研究认为氧化应激是糖尿病发生发展过程及其并发症出现的重要病理因子之一[4]，还有研究认为机体抗氧化能力减弱者易患糖尿病[5]。

GST超家族酶被认为能通过与氧化物质底物结合从而可以保护细胞免于氧化损伤[6]。GST基因多态性与多种疾病存在相关性，然而其与糖尿病的相关性研究甚少。H.Fujita等[7]对日本人群Ⅱ型糖尿病患者中患有糖尿病肾病和未患有糖尿病肾病患者的GSTM1基因多态性进行研究，发现GSTM1基因缺失型在糖尿病合并糖尿病肾病及未合并糖尿病肾病患者中的发生频率分别为48.6%和55.1%，其认为GSTM1基因多态性与糖尿病肾病的发生无相关性。在我们此次研究中发现，GSTM1基因缺失型在对照组中的发生频率为35.45%，而在糖尿病患者中的发生频率高达72.23%，其基因分布差异有明显统计学意义；OR值为4.757，表明GSTM1基因缺失型为糖尿病发生的高危易感因素。

本研究初步探讨了中国咸阳地区的糖尿病患者与GSTM1基因多态性的相关性，结果显示GSTM1基因缺失型为该地区糖尿病的高危易感因素。然而，本研究存在一定的局限性，包括样本量不够大，且只局限于陕西咸阳地区的糖尿病患者，有待于大样本、多地区、多中心的进一步研究。

[1] 唐开发, 邢俊平, 孙发. 谷胱甘肽S-转移酶基因多态性与男性不育[J]. 中华男科学杂志, 2013(03):266-269.

[2] Lyons T J. Oxidized low density lipoproteins: a role in the pathogenesis of atherosclerosis in diabetes[J]. Diabet Med, 1991, 8(5):411-419.

[3] Raza S, Abbas S, Ahmad A, et al. Association of Glutathione-S-Transferase (GSTM1 and GSTT1) and FTO Gene Polymorphisms with Type 2 Diabetes Mellitus Cases in Northern India[J]. Balkan J Med Genet, 2014, 17(1):47-54.

[4] Shinde S N, Dhadke V N, Suryakar A N. Evaluation of Oxidative Stress in Type 2 Diabetes Mellitus and Follow-up Along with Vitamin E Supplementation [J]. Indian J Clin Biochem, 2011, 26(1):74-77.

[5] Baynes J W, Thorpe S R. Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm [J]. Diabetes, 1999, 48(1):1-9.

[6] Rodriguez-Ramiro I, Ramos S, Bravo L, et al. Procyanidin B2 induces Nrf2 translocation and glutathione S-transferase P1 expression via ERKs and p38-MAPK pathways and protect human colonic cells against oxidative stress[J]. Eur J Nutr, 2012,51(7):881-892.

[7] Fujita H, Narita T, Meguro H, et al. No association of glutathione S-transferase M1 gene polymorphism with diabetic nephropathy in Japanese type 2 diabetic patients [J]. Ren Fail, 2000, 22(4):479-486.

Correlation study on the glutathione S-transferase M1 gene polymorphisms in patients with diabetes mellitus

LiHaiyan,ZhangHuanhuan,YangYanping,LiRongrong

DepartmentofGeriatricMedicine,theNo. 215HospitalofShaanxiNuclearIndustry,Xianyang712000,Sanxi,China

Objective To investigate the association of glutathione S-transferase M1 (GSTM1) gene polymorphism in patients with diabetes mellitus. Methods The GSTM1 genotypes were identified by multiplex polymerase chain reaction (PCR) with peripheral blood DNA samples from patients or controls. Results The frequencies of null GSTM1 genotypes in the patients with diabetes mellitus and controls were 72.32% and 35.45%, respectively. There were statistical significantly differences of frequencies of null GSTM1 genotypes between the cases group with control group (P<0.01). Conclusion The null alleles of GSTM1 may be a strong predisposing risk factor for diabetes mellitus.

Diabetes mellitus； Glutathione S-transferase M1 gene; Polymorphisms

陕西省科学计划项目(2012K15-02)

R587.1；R313

A

1000-744X(2016)06-0567-02

2016-04-08)