林荣 林琳 贾兴泽 高妍 张文 刘向红 任莉

(1.冀中能源邢矿集团总医院心内科 河北 邢台 054000；2.大连大学附属中山医院影像科，辽宁 大连 116000 )

·实验研究·

心肌缺血再灌注损伤后对线粒体功能的影响和能量代谢的变化研究

林荣1林琳2贾兴泽1高妍1张文1刘向红1任莉1

(1.冀中能源邢矿集团总医院心内科 河北 邢台 054000；2.大连大学附属中山医院影像科，辽宁 大连 116000 )

目的 探讨心肌缺血再灌注损伤(I/R)后心肌细胞线粒体功能和能量代谢的影响。方法 将实验大鼠分成正常对照组(A组)、单纯缺血组(B组)、缺血再灌注损伤组(C组)，每组6只。大鼠脱颈椎处死建立离体心脏，成功制作心脏缺血模型、I/R模型，各组灌流结束后，取大鼠左心室全层心肌标本，提取蛋白，监测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和细胞色素C(Cyt-c)；收集灌流后的液体，监测心肌生化指标。结果 与A组和B组比较，C组AMPK表达显著降低，Cyt-c显著升高； C组心肌CK、LDH、CK-MB呈高表达，与A组和B组分别相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 心肌缺血再灌注损伤后，心肌细胞线粒体损伤较缺血期更严重，心肌能量蛋白AMPK表达显著降低，代谢减慢，代谢物质堆积，心肌损伤生化指标表达升高。

心肌缺血再灌注损伤； 线粒体功能； 能量代谢

心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion ,IR)是指心肌缺血后恢复血流，心肌细胞的代谢功能和结构反而出现了较缺血前更重的现象[1]。线粒体存在于除哺乳动物成熟红细胞以外的真核细胞中，是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所。为机体提供95%以上的能量，线粒体的功能异常与心血管疾病的发生、发展有密切联系，本研究旨在研究心肌缺血再灌注损伤后对心肌细胞线粒体功能的影响和能量代谢的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 成年雄性大鼠18只，400 g左右(河北医科大学实验动物室)，本实验遵循国家动物实验管理条例和实施细则，Langendorff 离体实验灌流实验系统，肌酸肌酶(CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸肌酶同工酶(CK-MB)所有试剂均由南京建成生物制品有限公司制造。AMPK、Cyt-c和其抗体均由美国(Cell Signaling Technology)公司出品。

1.2 实验方法 (1)标本模型制作，采用戊巴比妥钠给雄性大鼠肌注，麻醉满意后，将大鼠仰卧固定，剖开前胸，迅速取出离体心脏放置于4 ℃ K-H缓冲液中，轻轻挤压心脏，排空其中残留的血液，行主动脉插管，丝线结扎，迅速固定于Langendorff 离体实验灌流装置中，用含95%O2和5%CO2K-H缓冲液，缓冲液温度控制在37 ℃左右，pH值7.4，恒压逆行灌流，灌流压力为80 cm H2O压力。A组持续灌流90 min；B组平稳灌流30 min后，停灌30 min；C组持续灌流30 min，停灌30 min，然后再灌流30 min。(2)采用Western blot 印迹法，取灌流后大鼠左室全层心肌作标本，分离提取目的蛋白，监测AMPK、Cyt-c的蛋白表达。具体方法：将100 mg组织剪碎加入0.5 mL裂解液，用组织匀浆器粉碎组织；取组织匀浆液0.5 mL加1 mL的抽提试剂，充分混匀。加转膜缓冲液1 000 g，4 ℃离心10 min，溶液分成上下两层，当中即为提取的蛋白膜，吸附上现两层液体，室温干燥沉淀10 min，然后用半转干法进行电泳转移，用一抗稀释4 ℃孵育过液，加入酶标二抗，用Western blot专用发光试剂A液、B液以1∶1混合液，滴在膜上与之结合3 min,放入凝胶呈像系统曝光。利用凝胶呈像系统图像分析软件分析蛋白条带的光密度值。

1.3 心肌生化指标监测 分别采集各组冠状动脉流出液，按照试剂说明书，监测CK、LDH、CK-MB的生物活性。

2 结 果

2.1 三组灌流液AMPK、Cyt-c的蛋白表达 与A组和B组比较，C组AMPK表达显著降低，三组呈递减形式；表明心肌缺血再灌注后导致AMPK表达下降；而Cyt-c蛋白表达显著升高，三组呈递增态势。表明Cyt-c释放增多，线粒体功能下降，细胞凋亡加速，见图1、2。

图1 AMPK蛋白表达 图2 Cyt-c 蛋白表达

2.2 三组灌流液生化指标监测比较 与A组和B组相比，C组心肌生化指标CK、LDH、CK-MB显著升高，与2组分别相比差异均有统计学意义(P<0.05)；提示心肌缺血再灌注组细胞的损害更严重，见表2.

表1 心肌细胞损伤生化指标比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05;与B组比较，△P<0.05。

3 讨 论

心肌梗死后及时进行溶栓或介入治疗是保证血液供应再恢复的治疗措施，但对灌注后的心肌细胞再损伤，一直是临床上研究的热点。当心肌发生缺血缺氧时，心肌细胞线粒体的Ca2+超载、活性氧的大量释放、线粒体膜通道开放等导致线粒体功能障碍和结构破坏，是心肌细胞再灌注损伤的主要原因[2]。心肌细胞拥有最大的线粒体密度，约占其细胞体积的45%，对调控心肌细胞凋亡和能量代谢起着重要的作用[3]。线粒体与再灌注损伤的关系，可分为3个阶段。心肌缺血初期:组织细胞缺氧，导致线粒体氧化磷酸化的水平下降，细胞内磷酸肌酸很快耗竭并释放出大量无机磷，促进了糖酵解和乳酸生成，细胞内pH值下降，细胞酸中毒。缺血延长期：随着缺血时间的延长，线粒体功能与结构损害，ATP的产生减少利用却增加。线粒体呼吸链中Cyt-c 增高，打断电子传递链，促进氧自由基的形成，使细胞缺少ATP而死亡。再灌注期：大量氧自由基生成，Ca2+超载，MPT发生，最终导致细胞死亡[4]。

AMPK是一种高度保守的丝氨酸，广泛存在于细胞中，参与机体多种代谢反应，被誉为真核细胞的“代谢感受器”，是调节机体能量平衡的总开关[5]。当机体受到任何能引起ATP生成减少与消耗增加的应激刺激的初期，AMPK被激活，参与糖酵解，维持细胞能量供应。它不但能调节糖、脂的代谢，增加糖的利用，降低胆固醇和脂肪的合成，降低细胞内甘油三脂的含量，从而减缓了IR的发生，同时还能提高血管内皮细胞的防御能力。随着IR损伤的继续加重，大量心肌细胞坏死，无氧代谢物聚积，AMPK被大量消耗殆尽，导致在IR蛋白测试中低表达。本实验结果，IR组与缺血组和正常对照组相比，AMPK呈递减状态，说明IR后导致AMPK的蛋白表达功能降低。Cyt-c 具有双重功能，除参与电子传递外，在细胞凋亡的启动中，Cyt-c 作为细胞凋亡的起始因子，起着非常重要的作用。大量的细胞凋亡又促使了Cyt-c 的释放，进一步加速了心肌细胞的凋亡。本组实验中IR组，与正常对照组和缺血组相比，Cyt-c 在血液中高表达，三组呈递增状态，说明Cyt-c 的升高与心肌细胞的损伤程度呈正相关[6-7]。心肌细胞内LDH、CK等在细胞膜完整的情况下，不能渗出细胞膜进入循环，当心肌细胞出现缺血缺氧时，细胞膜通透性增加，才能释放入血，缺血再灌注损伤后，心肌出现变性、坏死，LDH、CK等外渗，血清中CK-MB的定量测量常被用作心肌损害的辅助诊断，因此，CK-MB水平升高常常与急性心肌梗死细胞死亡和损伤相关联[8]。

本实验结果得知，IR组LDH、CK、CK-MB显著升高，与缺血组、正常对照组分别相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示心肌再灌注后心肌细胞没有因为供血的恢复而减少心肌细胞的损害，反而加重了功能的损害。保护线粒体功能是延缓和减少心肌细胞损害的关键，这与赵艳艳，徐盟等[9-10]的研究相一致，在再灌注后期运用抗凋亡和抗炎物质，保护线粒体的功能，从而减少对心肌的损害程度，可为临床治疗提供帮助。

[1] 刘军峰，贾克刚，郑大勇，等.心肌缺血再灌注损伤实验指标的研究现状[J].中国老年学杂志，2010，30(23)：3607-3609.

[2] 杨黄恬，王志华，刘金龙，等.线粒体在心肌缺血再灌注损伤与保护中的重要作用[J].中国病理生理杂志，2015，10：1822-1826.

[3] 余福林.缺血/再灌注损伤后心肌细胞线粒体功能及其能量代谢变化[D].延安大学，2011.

[4] 李妮妮.缺血后处理和ATP后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[D].青岛大学，2010.

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[6] 吕磊，徐军.心肌缺血再灌注损伤中线粒体保护作用的研究进展[J].东南大学学报，2015，34(1)：131-134.

[7] 余福林，李红梅，高延，等.缺血再灌注损伤后心肌细胞线粒体功能及其能量代谢变化[J].西北国防医学杂志，2013，34(2)：113-115.

[8] 赵亚玲，敖虎山.心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J].中国循环杂志，2011，26(5)：396-398.

[9] 赵艳艳，李运伟，王全河，等.心肌细胞内Livin蛋白过表达对大鼠心肌缺血再灌注中细胞凋亡的影响[J].中国循环杂志，2010，25(4)：309-312.

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