蒋文明，王 艳，李金平，侯广宇，彭 程，刘 朔，王素春，黄保续，陈继明

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135）

2014—2016年华东地区某市活禽市场禽流感流行病学调查与分析

蒋文明1，王 艳2，李金平1，侯广宇1，彭 程1，刘 朔1，王素春1，黄保续1，陈继明1

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135）

为了解华东地区某市活禽市场中禽流感病毒的污染状况，2014—2016年对该市活禽市场的家禽进行了禽流感流行病学调查。结果显示：该市活禽市场禽流感病毒污染面较广，94.12%的市场存在禽流感病毒污染；H9N2亚型病毒感染率较高，样品总体阳性率为22.66%，场点总阳性率为94.12%；H7N9亚型病毒感染率经历了一个升降过程，2015年上半年达到高峰，之后显著降低；农贸市场中的H7N9亚型病毒分离率显著高于批发市场。本次调查未在活禽市场中检出H5亚型高致病性禽流感病毒。这些数据为深入了解活禽市场中禽流感病毒的污染状况和该病防控措施的制定提供了技术支持。

活禽市场；禽流感病毒；H7N9；H9N2

禽流感是由禽流感病毒（Avian infuenza virus，AIV）引起的高度接触性传染病。AIV为负链单股RNA病毒，根据表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）不同，可分为16种HA亚型和9种NA亚型[1]，根据致病力高低可分为高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）。HPAIV主要包括某些H5和H7亚型的病毒，其他亚型的病毒，如H9N2，都属于LPAIV。

H9N2 AIV在世界范围内的家禽和野鸟中广泛存在，也能够感染一些哺乳动物。自1998年以来，已有多起人感染H9N2 AIV的报道[2]。此外，H9N2 AIV存在重组现象，可为形成跨种传播的新型流感病毒提供条件。如，1997年感染人的H5N1病毒、2013年感染人的H7N9病毒，以及2014年感染人的H10N8病毒，其内部基因均来源于H9N2病毒[3-5]。家禽中H7N9病毒属于LPAIV，对家禽不致病，但与人感染的H7N9病毒高度相似，某些位点突变后可能会发生对人致病的可能。

研究发现，活禽市场是重要的AIV污染地[6-7]，也是与消费者密切接触的场所。因此对活禽市场中的AIV进行流行病学调查具有重要的公共卫生意义。本研究于2014—2016年对华东某市的活禽市场进行了AIV流行病学调查与分析，为深入了解该地区活禽市场中的AIV污染状况和防控措施的制定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材

Qiaxtractor核酸提取工作站配套相关试剂、QIAxcel Advanced全自动毛细血管电泳分析仪配套试剂购自Qiagen公司；植绒拭子购自深圳麦瑞科林科技有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit购自Vazyme公司；SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 样品采集

2014—2016年，在华东某市的2个活禽批发市场和6个农贸市场进行了6次持续采样（17场次），共采集检测样品4 233份（批发市场3 824份、农贸市场409份）。其中，鸡样品3 600份、鸽样品625份、环境样品8份。

1.3 病毒分离

采集家禽的咽喉、泄殖腔双拭子置于加抗生素（庆大霉素、左旋氧氟沙星、阿奇霉素）的PBS-甘油采样液中（pH7.2～7.6），10 000 r/min离心10 min，取上清接种10～11日龄SPF鸡胚，0.2 mL/枚，37℃孵化96 h。每隔24 h照胚一次，用1%的鸡红细胞测定鸡胚尿囊液的血凝效价。

1.4 RNA提取

用Qiaxtractor核酸自动提取工作站，提取死胚及血凝阳性胚尿囊液中的病毒RNA，置-70 ℃保存备用。

1.5 HA和NA基因扩增

根据已发表的文献，合成扩增HA和NA基因的引物[8]。按照HiScript II One Step RT-PCR Kit说明书配置44.0 µL RT-PCR预混液，包括25.0 µL 2×RT-PCR Buffer，引物各2.0 µL（10 µmol/L），2.5 µL Enzyme Mix，12.5 µL ddH2O，加入6.0 µL RNA模板。RT-PCR反应条件为50℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后进行30个循环（94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min），最后72℃延伸7 min。利用QIAxcel毛细管电泳系统进行片段分析，PCR产物送上海生工进行测序鉴定。

1.6 序列分析

利用Clustal W软件将本试验中各分离株的HA基因序列与参考株HA基因序列进行比对，再用MEGA5.05软件对其HA1亚单位的部分序列进行谱系分析。谱系分析的参数设置如下：采用Neighbor-joining计算方法，核苷酸变异设为Kimura 2-parameter模式，各位点变异速率设为Gamma分布（Gamma参数为2.0）。Bootstrap值的计算设置为1 000个重复。

2 结果

2.1 各亚型禽流感毒株总体检测结果

从8个场点采集的17个场次的4 233份样品中，检出AIV 1 072株，样品总体阳性率为25.40%，场点阳性率为94.12%。1 072株AIV中包括H9亚型（89.46%）和H7亚 型（10.54%）2个HA亚型，其中H9N2亚型959份、H7N9亚型104份、H7N2亚型8份和H7N6亚型1份（表1）。

按样品类型分，家禽拭子样品AIV阳性率为25.32%（1 070/4 225），环境样品阳性率为25.00%（2/8）。

按宿主分，鸡样品AIV阳性率为28.83%（1 038/ 3 600），鸽样品阳性率为5.12%（32/625）。

表1 2014—2016年各亚型禽流感毒株阳性数及样品来源

2.2 H7N9亚型病毒检测结果

从8个场点采集的17个场次的4 233份样品中，检出104株H7N9亚型病毒。其中，89株来自鸡样品，15份来自鸽样品。

上述104株H7N9病毒来自2个批发市场和3个农贸市场（共12个场次），市场样品H7N9病毒总体阳性率为2.46%（104/4 233），场点总阳性率为70.59%（12/17）。2014—2016年活禽市场的H7N9病毒总体阳性率变化趋势见图1。

图1 2014—2016年不同时间活禽市场H7N9病毒样品总体阳性率比较

按场点分，农贸市场样品平均阳性率为11.98%，约为活禽批发市场样品平均阳性率（1.44%）的8.32倍，二者差异显著（P＜0.05）。2014年上半年到2016年上半年，农贸市场的样品阳性率都显著高于批发市场的样品阳性率（P＜0.05）。农贸市场和批发市场的样品阳性率变化趋势见图2。

对H7N9病毒的HA序列进行分析，结果显示，这些病毒与同期感染人的H7N9病毒HA氨基酸同源性较高（97.5%～99.1%），亲缘关系较近（图3）。HA裂解位点处的氨基酸为PEIPKGRG，为典型的低致病性禽流感分子特征。禽H7N9病毒与人H7N9病毒的受体结合位点一致，第226位氨基酸为酪氨酸（L），能够结合α2，6-唾液酸受体，具有人样受体特征。

图2 2014—2016年不同时间活禽批发市场与农贸市场H7N9病毒阳性率比较

图3 2014—2016年华东某市活禽市场部分H7亚型AIV HA基因进化分析

2.3 其他H7亚型病毒检测结果

除H7N9病毒外，还检出8份H7N2和1份H7N6病毒，均为弱毒。序列分析显示，这些H7N2和H7N6病毒与H7N9病毒HA基因同源性较高，亲缘关系较近（图3）。

2.4 H9N2亚型病毒检测结果

从8个场点采集的17个场次的4 233份样品中，检出959份H9N2病毒阳性样品，样品总体阳性率为22.66%，场点总阳性率为94.12%（16/17）。

按宿主分，鸡样品阳性率为26.11%（940/3 600），鸽样品为2.72%（17/625），家禽环境样品为25.00%（2/8）。

按场点分，活禽批发市场样品阳性率为23.09%（883/3 824），场点阳性率为90.00%（9/10）；活禽零售市场样品阳性率为18.58%（76/409），场点阳性率为100.00%（7/7）。

HA基因系统进化分析表明，分离的病毒均属于h9.2.4.5分支（图4）。HA氨基酸序列分析显示，裂解位点处的氨基酸为PSRSSRGLF，为典型的低致病性禽流感分子特征。第226位氨基酸为酪氨酸（L），能够结合α2，6-唾液酸受体，具有人样受体特征，具备了感染人的部分基因特征。

3 讨论

从市场调查的结果来看，该市94.12%的活禽市场存在AIV感染，其中，94.12%的活禽市场存在H9N2病毒感染，70.59%的活禽市场存在H7亚型病毒感染，说明活禽市场的AIV污染面较广，绝大多数市场存在AIV污染。其他研究者对部分省份活禽市场的调查结果也显示，活禽市场是AIV的重要污染地[6-7]。

该市活禽市场中的H9N2亚型病毒感染率较高。从基因上分析，大部分H9N2病毒具备结合人样流感受体的能力，对人具有一定的潜在威胁，以前的试验也验证了这一点[9]。Jiang等[10]发现79%的H9N2病毒能够结合α2，6-唾液酸受体。Matrosovich等[10]发现，从香港活禽市场分离到的H9N2 AIV也能够结合α2，6-唾液酸受体，进一步证明其具有感染人的能力。H9N2亚型病毒虽然属于LPAIV，但近年来已报到多起人感染H9N2病毒病例。而且，2013年的人H7N9病毒和2014年的人H10N8病毒，其内部基因皆来自H9N2亚型AIV，所以H9N2病毒的潜在威胁和公共卫生意义值得进一步关注。

图4 2014—2016年华东某市活禽市场部分H9N2亚型AIV HA基因进化分析

H7N9亚型AIV感染率经历了一个先上升后下降的过程，2015年上半年达到高峰，2015年下半年，感染率开始显著降低，与同期感染人的H7N9病毒数据一致。这可能与该市各级政府采取的休市、消毒等措施紧密有关。H7N9病毒以后的走势值得进一步关注。

农贸市场中的H7N9病毒分离率显著高于批发市场，提示在家禽从批发市场转到农贸市场过程中及之后，H7N9病毒在家禽群体中也有一个显著扩增和扩散过程，对外扩散风险增高，且存在继续扩大、循环放大的风险。

2014—2016年，未在该市的活禽批发市场和农贸市场中检出H5亚型HPAIV，说明该市H5亚型AIV感染率较低。

家禽从养殖到餐桌一般要经历“养殖场—批发市场—农贸市场（零售市场）—消费者”4个环节。这4个环节中，批发市场和农贸市场，尤其是农贸市场，是与消费者密切接触的环节。调查表明，批发市场的家禽大都来自规模化养禽场，相对比较干净，携带病毒较少。待家禽进入农贸市场后，家禽携带的病毒量大大增加，这可能与市场环境有相当大的关系。

基于以上结果和分析，建议继续加强对活禽市场的禽流感流行病学调查和监测监管，有条件的地方尽早取缔活禽市场，大力发展冰鲜禽等替代品。短期内难以取缔活禽市场的地方，需要加强活禽市场的综合卫生防疫管理，建立严格的清洗、消毒、休市和家禽分区隔离制度，控制家禽在活禽市场中的停留时间和活动范围，推进入市活禽当日宰杀制度，以确保公共卫生安全。

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（责任编辑：朱迪国）

Epidemiological Survey and Analysis on Avian Influenza Virus in Live Bird Markets in a City of Eastern China during 2014—2016

Jiang Wenming1，Wang Yan2，Li Jinping1，Hou Guangyu1，Peng Cheng1，Liu Shuo1，Wang Suchun1，Huang Baoxu1，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

In order to recognize the contamination situation of avian influenza virus（AIV）in live bird markets（LBMs）in a city of eastern China，an epidemiological investigation on AIV towards poultry in LBMs was carried out during 2014—2016. The results showed that there was a wide range of AIV contamination in LBMs，and 94.12% of the investigated LBMs were infected by AIV. Among them the infection rate of H9N2 virus was relatively high（an overall positive rate of 22.66%），and at the farm level the positive rate was 94.12%.The infection rate of H7N9 virus has presented a rise-and-fall process，it reached the peak in the frst half year of 2015，then decreased obviously. The isolation rate of H7N9 subtype in retail markets was signifcantly higher than that in wholesale markets. In addition，the H5 subtype highly pathogenic avian influenza virus wasn’t detected during this investigation. In a conclusion，theses data will provide technical supports for deeply understanding the contamination of AIV in LBMs，as well as establishing appropriate prevention and control measures for AI.

live bird markets（LBMs）；avian infuenza virus（AIV）；H7N9；H9N2

book=14,ebook=20

S852.65

A

1005-944X（2017）01-0014-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.004

科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）；中国动物卫生与流行病学中心创新基金（2015IF-0003YM）；青岛市科技计划（14-2-4-105-jch）

陈继明