罗 璋，罗季委，李海锦，贺巨炬，彭 旺，李润成，余兴龙，肖朝庭

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南大学生物学院，湖南长沙410082）

猪星状病毒2型PCR检测分型方法的建立及初步应用

罗 璋1，罗季委1，李海锦1，贺巨炬1，彭 旺1，李润成1，余兴龙1，肖朝庭2※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南大学生物学院，湖南长沙410082）

根据GenBank登的猪星状病毒2型（PAstV2）序列，设计1对引物。通过优化反应条件，首次在湖南地区检测到PAstV2型病毒。用该方法通过提取样品RNA，采用RT-PCR进行扩增，得到一条预期的特异性条带（243bp），将扩增产物进行测序分析，结果表明该序列与PAstV2型的参考序列同源性为96％。同时，用该引物检测可引起腹泻的PEDV、TGEV、CSFV和PRRSV四种病毒RNA，RT-PCR结果均为阴性。该RT-PCR的敏感性试验结果表明其最高敏感度为400 pg/μL。采用该方法对湖南境内78份猪肠道和粪便样品进行检测，发现PAstV2型的感染率达到11.5％（9/78）。结果表明该方法可以应用于临床PAstV2检测。

猪星状病毒；基因型；PCR；PAstV2

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与病料

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）由湖南农业大学动物医学院预防兽医实验室保存；猪瘟病毒（CSFV）和猪蓝耳病病毒（PRRSV）来自于普莱科生物疫苗毒；78份猪粪便和肠道收集于湖南不同地区的猪场。

1.1.2 主要试剂

RNA抽提试剂Trizo1Reagent购自Invitrogen公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；Taq DNA聚合酶Mix购自天恩泽生物有限公司；无R N A酶水购自生工生物工程有限公司，其他常规试剂均为国产，分析纯。

1.1.3 样品处理

取病猪的粪便0.2g，加入1mL无RNA酶水，用旋涡混合仪震荡混匀后，放入高速台式冷冻离心机12 000r/min离心5min，取上清液至-20℃冰箱贮存。……