徐婕 卢奕

·综 述·

MicroRNAs 和年龄相关性白内障相关性的研究进展

徐婕 卢奕

MicroRNAs(miRNAs)是一类长18～25 个核苷酸的单链非编码小分子RNA，属于表观遗传学范畴，广泛存在于真核细胞中，通过其表达量的上调和下调，影响细胞分化、增殖、凋亡，肿瘤发生，机体代谢以及衰老等生命过程。近年来有研究发现，miRNAs在眼部的晶状体中也有表达，其表达量的异常可能与年龄相关性白内障(ARC)有密切关系。本文主要就miRNAs与ARC相关性的研究进展作一综述。(中国眼耳鼻喉科杂志，2017，17：136-139)

MicroRNAs；晶状体；靶基因；年龄相关性白内障

白内障是世界首位致盲性眼病，而年龄相关性白内障(age-related cataract， ARC)是其中最主要的类型。目前，通过手术摘除混浊的晶状体并植人工晶状体是治疗ARC的唯一有效方法。但是，白内障术后不可避免地存在手术并发症和屈光调节问题，而且手术设备和材料耗资巨大，已成为了世界各国严重的医疗负担[1]。因此通过研究ARC的发病机制寻找其非手术治疗的方法，成为了当前研究热点，microRNAs(miRNAs)的发现为全面阐释ARC的发病机制提供了新视角。

miRNAs是一类内源性的非编码小分子RNA，长18～25个核苷酸(nt)，通过碱基配对特异性结合到靶mRNA上的3′非翻译区(untranslated regions, UTR)，使之降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因表达[2]。近年来，越来越多的研究[3-5]表明，miRNAs的异常表达与ARC的发生密切相关，miRNAs的研究为ARC的治疗带来了新希望。本文主要综述了miRNAs的生物合成、作用及作用机制、靶基因的预测，在晶状体中的表达，及其与ARC相关性的研究进展。

1 miRNAs的生物合成

miRNAs的生物合成过程较复杂。首先，在RNA聚合酶Ⅱ和(或)Ⅲ作用下[6-7]转录出一个含发夹样结构miRNA前体pri-miRNA的长转录本，之后pri-miRNA在细胞核内被RNaseⅢ酶家族成员Dorsha和双链RNA结合辅助因子DGCR8(DiGeorge syndrome critical region 8)等组成的DROSHA复合物加工成一茎环结构pre-miRNA，长约70nt，然后经Exportin-5从细胞核转运至细胞质；随后，Dicer酶将pre-miRNA从miRNA前体的茎区域中剪切出来，加工成长20～24 nt的双链miRNA；最终，双螺旋解旋，其中一条通过与互补序列结合形成miRNA诱导的沉默复合体RISC(RNA-induced silencing complex)[8-10]。

2 miRNAs的作用及机制

miRNAs广泛存在于真核细胞中，通过其表达量的上调和下调，发挥调控基因表达的作用，从而影响细胞分化、增殖、凋亡,肿瘤发生,机体代谢以及衰老等生命过程[5,11]。

miRNAs的5′末端6～7 nt被称为种子区域，通过碱基互补配对原则与位于靶mRNA 3′UTR的miRNA调控元件(miRNA regulatory element，MRE)互相作用，从而识别靶mRNA[12]。miRNAs具体是如何发挥基因沉默效应的？目前尚未完全阐明。已有研究[13-14]表明Ago蛋白在miRNAs介导的基因沉默过程中起着关键作用。Ago蛋白定位于细胞中降解mRNA的RNA颗粒，以miRNAs为向导，与靶mRNA特异性结合后，使靶mRNA在RNA颗粒中被降解或重新释放进入翻译机器。

然而，Vasudevan等[15]发现，miRNAs的调节效应在细胞周期中并不是固定不变的，而是在抑制和活化之间摆动，在静止期活化翻译，在其他细胞循环周期/增殖期则抑制翻译。而且miRNAs的效应也并非不可逆转，在某些条件下，被miRNAs抑制的靶mRNA可以去抑制[16-17]。

此外，最新研究还发现miRNAs的作用远比此要广泛，如Schmiedel等[18]的研究证实miRNAs可以作为基因组噪音的阻尼器，控制蛋白表达的精确性；Picao-Osorio等[19]则首次揭示了一种可以控制精确行为的miRNA(miR-iab4/8)，这项研究为人们展示了一个由miRNAs编码的行为。

3 miRNAs的靶基因预测

miRNAs的调节效应很大限度上取决于对靶基因的识别，一种miRNA可以识别多种靶mRNA，多种miRNAs可以识别同一种靶mRNA[20]。靶基因预测是研究miRNAs生物学功能的关键。目前靶基因预测方法主要有计算机生物信息学软件预测和生物学实验方法，前者主要有TargetScan，miRanda和PicTar等；后者主要有利用免疫共沉淀方法寻找与Ago蛋白相互作用的mRNA或者通过mRNA和蛋白质水平变化来反向推断miRNAs的靶基因[21-22]。然而由于mRNA的长度很短，而且和靶基因之间并非完全互补，因此预测仍然存在较大难度[22]

4 miRNAs在晶状体中的表达

晶状体是眼球屈光系统重要的组成部分，随着年龄增长，晶状体上皮细胞的凋亡引起晶状体混浊，从而导致ARC的发生。目前检测miRNAs在晶状体中的表达主要方法有微阵列分析、实时定量PCR、RNA印迹以及原位杂交[23]。Wu等[21]用微阵列表达谱在人晶状体中发现了206种miRNAs，其中在ARC患者晶状体中表达量位于前8位的为miR-184、miR-1826、let-7b/c、miR-24、miR-23b、miR-923和miR-23a，而晶状体透明者中前8位为miR-184、let-7b、miR-923、miR-1826、miR-125b、miR-1308、miR-26a和miR-638。相较于透明晶状体者，ARC患者晶状体中有20种miRNAs的表达量明显下降，尤以miR-933为显著；12种miRNAs表达量明显增加，以miR-34a为显著。Kubo等[11]用RT-PCR也发现在Shumiya白内障大鼠的晶状体中，let-7c、miR-29a、miR-29c和miR126的表达量下调。以上研究表明，miRNAs表达量的异常可能与ARC的发病有关。

然而目前发现的miRNAs数目还远未达到饱和，人晶状体的miRNAs表达谱建立还需要不断扩增完善，尤其是对ARC患者晶状体的miRNAs表达谱研究还比较少。由于现在很多miRNAs是在细胞的混合期发现的，如果能筛选出特定细胞类型或特定时期，以及研究方法和高通量技术的不断发展，有可能发现更多的miRNAs。

5 miRNAs与ARC的相关性

ARC是在中老年开始发生的晶状体混浊，为多种因素混合作用的结果，如紫外线、氧化损伤、物理损伤、营养，衰老和遗传基因等因素在此过程中发挥了作用，晶状体上皮细胞的凋亡可能是其重要的细胞基础。然而目前的研究还尚未对ARC的发生机制形成系统的理解，也未能发现其中的关键环节和靶点，因此仍未研制出有效的干预措施。近年来越来越多的研究者认为miRNAs与ARC发病密切相关，Kubo等[11]对晶状体中的miR-29、miR-126、miR-136、let-7等进行了靶基因预测，发现晶状体中大多miRNAs的靶基因如TPm1α/2β、Prdx6、TGF-βs、FGF等都和晶状体发育以及白内障形成相关[11,24]。其他研究者也发现let-7、miR-34a和miR-125b等miRNAs与ARC存在相关性[3-5]。

5.1 let-7与ARC的相关性 let-7家族是目前研究较多的一个miRNA家族，现已发现该家族有13个成员，分别位于第3,9～12,19,21,22和X染色体9个不同位点上[25]。let-7家族生物学功能十分广泛，其表达量的异常会使细胞增殖分化基因功能紊乱[26]，引起细胞和组织的衰老[27]，进而可能与ARC的发生相关[5]。

有研究者发现成年蝾螈可以通过背侧虹膜的色素上皮细胞分化来实现晶状体再生，而let-7b的表达与此过程密切相关，let-7b的过表达会使此去分化过程受到抑制，从而可能会引起晶状体的老化[28]。Peng等[5]也发现晶状体上皮细胞中let-7b的表达水平在ARC患者中，是随着年龄增加而增加的，超过85岁ARC患者的晶状体上皮细胞中let-7b的水平是55～64岁患者的1.15倍，并且用晶状体混浊分类系统Ⅲ(Lens Opacities Classification System Ⅲ，LOCSⅢ)对患者进行分级后发现，let-7b的水平越高，则白内障混浊等级也越高，而let-7a和let-7c与患者年龄和晶状体混浊程度无明显相关性。Kubo等[21]对let-7b的靶基因进行了预测，发现其大多靶基因如纤维原细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)等均与晶状体的发育有关，FGFs基因的异常表达会引起晶状体混浊[29]。

农田水利基本建设再超历史。共完建各类水利工程32万余处，完成土石方11亿m3。完成37座中型、2 529座小型水库除险加固任务。抓紧推进荆南四河堤防加固工程建设。已实施的73个中小河流治理项目全部完工，并完成绩效评估。35个大中型灌区续建配套与节水改造、13个大型灌排泵站更新改造项目进展顺利。完成63个中央财政小农水重点县年度建设任务，并连续三年被水利部、财政部考评为优秀等次。出台《湖北省农村供水管理办法》，全年可再解决260万农村居民饮水安全问题。治理水土流失面积1 850km2。完成47个农村水电增效扩容改造试点绩效评价工作。

由以上研究推测，晶状体上皮细胞中的let-7，尤其是let-7b的表达可能参与了调控晶状体衰老的发展过程，let-7b的水平增加，会使晶状体上皮细胞功能异常，最终可能导致ARC的形成。

5.2 miR-34与ARC的相关性 miR-34家族在脊椎动物基因组中包括3个成员，其中人miR-34a定位于1号染色体长臂3区6带(1p36)，而miR-34b和miR-34c则定位于11q23[25]。miR-34通过调控众多靶基因来发挥多方面的生物学功能，其中诱导细胞凋亡与衰老的功能主要通过p53通路来实现；miR-34家族受p53的直接调节，并通过抑制SIRT1和YY1上调p53，从而形成正反馈循环[30-31]。

Maes等[32]在过氧化氢诱导的早衰模型中发现了表达上调的miR-34a；Fujita等[33]也发现反义抑制miR-34a可以阻止衰老性复制的起始；Yang等[34]在研究秀丽隐杆线虫时还发现miR-34的功能缺失突变可以延长其寿命，并提高其抗氧化损伤能力，而氧化损伤与ARC的形成又密切相关[35]。有研究者[4, 36]对110个ARC患者的晶状体上皮样本进行了miR-34a的检测，发现ARC患者的年龄越大，miR-34a的表达水平则越高，并且随LOCSⅢ分级系统评分的升高而升高，其过程可能与SIRT1有关。miR-34a的过表达抑制了SIRT1的表达，从而可能导致晶状体的老化、ARC形成。然而，目前的研究还尚未阐明miR-34与ARC之间的确切机制。

5.3 miR-125与ARC的相关性 人类miR-125家族由3种同源miRNAs组分组成，分别为miR-125a、miR-125b1和miR-125b2，其中miR-125a位于19q13，miR-125b1位于11q23，miR-125b2位于21q21[25]。

近年来已有越来越多的研究表明miR-125与细胞凋亡密切相关。Bcl-2家族可能是该相关性中一个重要的枢纽，其中Bcl-w[37]、Bcl-2[38]和Mcl-1[37]具有抗凋亡作用，而Bak-1[39]作为Bcl-2同源物的拮抗剂，具有促进凋亡的作用，它们均为miR-125的直接靶基因。miR-125表达异常使Bcl-w、Bcl-2和Mcl-1水平下降或Bak-1水平上升均可促进细胞发生凋亡。Tan等[40]还发现细胞遭受紫外线损伤后，可以通过激活NF-kB上调miR-125的水平，从而抑制靶基因p38α的表达，提高细胞对紫外损伤诱导凋亡的抵抗能力，保护细胞避免发生凋亡。Zeng等[39]在研究喜树碱化疗药治疗癌症患者的机制时也发现，miR-125的水平下降可以上调其靶基因p53的表达，而p53具有促进细胞凋亡的作用。鉴于晶状体上皮细胞的凋亡是ARC发病的一个重要细胞基础，且在晶状体上皮细胞中可以检测到miR-125的存在[21]。那么miR-125是与否ARC发病存在相关性？Qin等[3]用RT-qPCR对56个ARC患者的晶状体前囊膜标本进行了检测，发现miR-125b的水平较正常对照组显著下降，且在用紫外线照射诱导晶状体上皮细胞凋亡的实验过程中，miR-125b的水平也是下降的。若在紫外线照射前将miR-125b的抑制剂注入晶状体上皮细胞中，细胞凋亡速率明显加快，而注射miR-125b的类似物则可以减慢晶状体上皮细胞的凋亡。通过进一步研究还发现p53可能是该凋亡过程中一个重要的靶基因，miR-125b的水平下降使p53表达上调，从而促使细胞发生凋亡。

综合以上研究结果，miR-125与细胞的凋亡过程密切相关，晶状体上皮细胞中的miR-125异常表达可以引起细胞发生凋亡，可能与ARC发病相关。

6 展望

目前，对miRNAs与ARC相关性的研究还处于初级阶段，miRNAs在晶状体中的表达情况及其对ARC的影响还有待进一步的深入探究。随着研究方法的不断改进和高通量技术的不断发展，miRNAs在晶状体中的表达谱将更加完善，其异常表达对ARC的影响机制也将进一步被揭示。现有研究已表明miRNAs通过碱基互补原则与靶mRNA结合，发挥基因沉默效应。有时候也可发挥正调节作用，从而调控相应蛋白质的水平，改变机体生理状态。此外，miRNAs还具有调节基因组表达的精确性甚至编码行为等更广泛的作用，miRNAs的效应在有些条件下还可以逆转。鉴于以上作用机制以及miRNAs天然、内源性、无毒性等特点，其在ARC的防治方面，显现出了较大潜能。然而，由于ARC的发病是多种因素混合作用的结果，是一个极其复杂的过程，虽然目前的研究已表明miRNAs的表达与ARC发病存在相关性，但是其确切机制仍不清楚，至今还未能发现其中的关键环节和靶点。而且miRNAs对靶基因的调控呈现出一对多和多对一的如网络般的错综复杂性；此外，miRNAs的长度很短且和靶基因之间并非完全互补，这些都大大增加了miRNAs靶位点预测的难度。目前还没有关于miRNAs可以防治ARC的研究报道，未来仍需继续探索和验证各种miRNAs的表达对ARC的影响，进一步明确其在ARC发病中的作用，从而为有效防治ARC的发生提供新的思路。

[ 1 ] Javitt JC, Steinberg EP, Sharkey P, et al. Cataract surgery in one eye or both. A billion dollar per year issue[J]. Ophthalmology, 1995,102(11):1583-1592, 1592-1593.

[ 3 ] Qin Y, Zhao J, Min X, et al. MicroRNA-125b inhibits lens epithelial cell apoptosis by targeting p53 in age-related cataract[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1842(12 Pt A):2439-2447.

[ 4 ] Chien KH, Chen SJ, Liu JH, et al. Correlation between microRNA-34a levels and lens opacity severity in age-related cataracts[J]. Eye (Lond), 2013,27(7):883-888.

[ 5 ] Peng CH, Liu JH, Woung LC, et al. MicroRNAs and cataracts: correlation among let-7 expression, age and the severity of lens opacity[J]. Br J Ophthalmol, 2012,96(5):747-751.

[ 6 ] Borchert GM, Lanier W, Davidson BL. RNA polymerase Ⅲ transcribes human microRNAs[J]. Nat Struct Mol Biol, 2006,13(12):1097-1101.

[ 7 ] Lee Y, Kim M, Han J, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II[J]. EMBO J, 2004,23(20):4051-4060.

[ 8 ] Murphy D, Dancis B, Brown J R. The evolution of core proteins involved in microRNA biogenesis[J]. BMC Evol Biol, 2008,8:92.

[ 9 ] Lund E, Guttinger S, Calado A, et al. Nuclear export of microRNA precursors[J]. Science, 2004,303(5654):95-98.

[10] Parker JS, Roe SM, Barford D. Molecular mechanism of target RNA transcript recognition by Argonaute-guide complexes[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2006,71:45-50.

[11] Kubo E, Hasanova N, Sasaki H, et al. Dynamic and differential regulation in the microRNA expression in the developing and mature cataractous rat lens[J]. J Cell Mol Med, 2013,17(9):1146-1159.

[12] Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]. Cell, 2005,120(1):15-20.

[13] Anderson P, Kedersha N. RNA granules[J]. J Cell Biol, 2006,172(6):803-808.

[14] Liu J, Valencia-Sanchez MA, Hannon GJ, et al. MicroRNA-dependent localization of targeted mRNAs to mammalian P-bodies[J]. Nat Cell Biol, 2005,7(7):719-723.

[15] Vasudevan S, Tong Y, Steitz JA. Cell-cycle control of microRNA-mediated translation regulation[J]. Cell Cycle, 2008,7(11):1545-1549.

[16] Bhattacharyya SN, Habermacher R, Martine U, et al. Relief of microRNA-mediated translational repression in human cells subjected to stress[J]. Cell, 2006,125(6):1111-1124.

[17] Sandberg R, Neilson JR, Sarma A, et al. Proliferating cells express mRNAs with shortened 3' untranslated regions and fewer microRNA target sites[J]. Science, 2008,320(5883):1643-1647.

[18] Schmiedel JM, Klemm SL, Zheng Y, et al. Gene expression. MicroRNA control of protein expression noise[J]. Science, 2015,348(6230):128-132.

[19] Picao-Osorio J, Johnston J, Landgraf M, et al. MicroRNA-encoded behavior in Drosophila[J]. Science, 2015,350(6262):815-820.

[20] Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009,136(2):215-233.

[21] Wu C, Lin H, Wang Q, et al. Discrepant expression of microRNAs in transparent and cataractous human lenses[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012,53(7):3906-3912.

[22] Thomas M, Lieberman J, Lal A. Desperately seeking microRNA targets[J]. Nat Struct Mol Biol, 2010,17(10):1169-1174.

[23] Tian L, Huang K, DuHadaway J B, et al. Genomic profiling of miRNAs in two human lens cell lines[J]. Curr Eye Res, 2010,35(9):812-818.

[24] Kubo E, Hasanova N, Fatma N, et al. Elevated tropomyosin expression is associated with epithelial-mesenchymal transition of lens epithelial cells[J]. J Cell Mol Med, 2013,17(1):212-221.

[25] Hsu SD, Chu CH, Tsou AP, et al. miRNAMap 2.0: genomic maps of microRNAs in metazoan genomes[J]. Nucleic Acids Res, 2008,36(Database issue):D165-D169.

[26] Fu TY, Chang CC, Lin C T, et al. Let-7b-mediated suppression of basigin expression and metastasis in mouse melanoma cells[J]. Exp Cell Res, 2011,317(4):445-451.

[27] Drummond M J, McCarthy J J, Sinha M, et al. Aging and microRNA expression in human skeletal muscle: a microarray and bioinformatics analysis[J]. Physiol Genomics, 2011,43(10):595-603.

[28] Nakamura K, Maki N, Trinh A, et al. miRNAs in newt lens regeneration: specific control of proliferation and evidence for miRNA networking[J]. PLoS One, 2010,5(8):e12058.

[29] McAvoy JW, Chamberlain CG, de Iongh R U, et al. Peter Bishop Lecture: growth factors in lens development and cataract: key roles for fibroblast growth factor and TGF-beta[J]. Clin Experiment Ophthalmol, 2000,28(3):133-139.

[30] Chen QR, Yu LR, Tsang P, et al. Systematic proteome analysis identifies transcription factor YY1 as a direct target of miR-34a[J]. J Proteome Res, 2011,10(2):479-487.

[31] Yamakuchi M, Ferlito M, Lowenstein CJ. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(36):13421-13426.

[32] Maes O C, Sarojini H, Wang E. Stepwise up-regulation of microRNA expression levels from replicating to reversible and irreversible growth arrest states in WI-38 human fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 2009,221(1):109-119.

[33] Fujita K, Mondal A M, Horikawa I, et al. p53 isoforms Delta133p53 and p53beta are endogenous regulators of replicative cellular senescence[J]. Nat Cell Biol, 2009,11(9):1135-1142.

[34] Yang J, Chen D, He Y, et al. MiR-34 modulates Caenorhabditis elegans lifespan via repressing the autophagy gene atg9[J]. Age (Dordr), 2013,35(1):11-22.

[35] Sawada H, Fukuchi T, Abe H. Oxidative stress markers in aqueous humor of patients with senile cataracts[J]. Curr Eye Res, 2009,34(1):36-41.

[36] Lin TJ, Peng CH, Chiou SH, et al. Severity of lens opacity, age, and correlation of the level of silent information regulator T1 expression in age-related cataract[J]. J Cataract Refract Surg, 2011,37(7):1270-1274.

[37] Gong J, Zhang JP, Li B, et al. MicroRNA-125b promotes apoptosis by regulating the expression of Mcl-1, Bcl-w and IL-6R[J]. Oncogene, 2013,32(25):3071-3079.

[38] Zhao A, Zeng Q, Xie X, et al. MicroRNA-125b induces cancer cell apoptosis through suppression of Bcl-2 expression[J]. J Genet Genomics, 2012,39(1):29-35.

[39] Zeng CW, Zhang XJ, Lin KY, et al. Camptothecin induces apoptosis in cancer cells via microRNA-125b-mediated mitochondrial pathways[J]. Mol Pharmacol, 2012,81(4):578-586.

[40] Tan G, Niu J, Shi Y, et al. NF-kappaB-dependent microRNA-125b up-regulation promotes cell survival by targeting p38alpha upon ultraviolet radiation[J]. J Biol Chem, 2012,287(39):33036-33047.

(本文编辑 诸静英)

Advances in the study of correlation between microRNAs and age-related cataract

XUJie,LUYi.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity，MyopiaKeyLabofHealthMinistry,Shanghai200031,China

LU Yi, Email: luyiox@163.com

MicroRNAs(miRNAs), widely presented in eukaryotic cells, are a class of single strand (18-25 nucleotides), non-coding, small RNA molecules, belonging to the domain of epigenetics. They play a critical role in a series of life processes, including cell differentiation, proliferation, apoptosis, tumorigenesis, individual metabolism and senescence by changing their expression levels. Recent studies have identified some miRNAs in the lens, whose aberrant expressions may be closely associated with the age-related cataract(ARC). This article mainly reviewed the advances in the research of correlation between miRNAs and ARC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:136-139)

MicroRNAs; Lens; Target genes; Age-related cataract

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 卫生部近视眼重点实验室 上海 200031

通迅作者：卢奕(Email: luyiox@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.02.019

2015-12-23)