王薇薇, 刘素琴, 薛 芸, 王 彦, 阎 超(上海交通大学药学院, 上海 200240)

邹汉法研究员纪念专辑(下)·专论与综述

核酸适配体在固相萃取技术中的研究进展

王薇薇, 刘素琴, 薛 芸, 王 彦*, 阎 超*
(上海交通大学药学院, 上海 200240)

核酸适配体是一种经由体外指数级富集系统进化技术筛选得到的随机寡核苷酸片段,该寡核苷酸片段能特异性结合靶物质。核酸适配体与固相萃取技术相结合,可以高选择性地应用于复杂样品中痕量组分的萃取、分离、富集和纯化,由此引起了广泛关注。该文综述了基于核酸适配体的固相萃取研究进展,着重评述了核酸适配体固相萃取柱的制备、固相萃取过程、面临的问题和应用前景。

固相萃取;样品前处理;亲和吸附;核酸适配体;复杂样品;综述

固相萃取(solid phase extraction,SPE)[1]因其易于实现自动化和灵活性高的特点,被广泛应用于分离和富集过程,已被认为是分析测试前对样品进行前处理的标准方法之一。SPE利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标分析物,使其与样品基质和干扰物分离,再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集目标分析物的目的。使用SPE吸附富集可大大增强分析物的检出能力,提高待测组分的回收率。SPE方法中固体吸附剂的选择是决定萃取效率、富集倍数和吸附材料使用寿命的重要因素。然而传统的SPE吸附材料(如C8、C18等)具有萃取选择性低的缺点,难以高效地用于复杂样品中痕量目标分析物的萃取和富集。

为提高SPE材料的选择性,一系列基于“分子识别”的功能化吸附剂被研发出来,主要包括基于抗体[2]、分子印迹技术[3]以及核酸适配体(aptamer)[4]的吸附材料。其中,基于抗体的吸附材料特异性强,但抗体的获得费时且昂贵[2]。分子印迹聚合物制备方便,然而模板的洗脱费时且难以达到洗脱完全的效果[3]。

近年来,已有不少研究以核酸适配体作为亲和配基应用于SPE,并获得了很好的效果。核酸适配体是一种经由体外指数级富集系统进化(systema-tic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)[5]技术筛选得到的随机寡核苷酸片段,可以是DNA或RNA,能特异性结合靶物质。核酸适配体可通过分子内的相互作用,如氢键、碱基互补配对等,形成多种三维空间结构,包括发夹、凸环、假结和G四联体结构等。依据这种三维空间结构,核酸适配体可以广泛地与目标结合,从金属离子[6]到小分子[7]、大分子蛋白质[8],乃至整个细胞[9]。核酸适配体又被称为“化学抗体”,但与抗体不同的是,核酸适配体可以大批量体外合成,这使核酸适配体在生物化学分析领域有更广泛的应用空间。

由于基于核酸适配体功能化材料的SPE方法具有高选择性和高特异性的特点,近年来受到广泛关注。本文着重综述基于核酸适配体的SPE技术研究进展,对基于核酸适配体的SPE材料的制备、SPE过程、应用、面临的问题和前景进行综述。

1 基于核酸适配体的固相萃取吸附剂

基于核酸适配体的SPE技术的核心是制备基于核酸适配体的吸附材料,这其中涉及固相载体的选择和活化、适配体的修饰及其在载体表面的固定。

1.1 载体的选择

选择合适的载体材料用于核酸适配体的固定对于基于核酸适配体的吸附剂的制备是很重要的环节。此载体材料需要具备以下属性:(1)化学/生物惰性,以便在SPE过程中不与分析物或基质产生化学反应;(2)能够在一定程度上耐受酸碱及有机溶剂,这样可以在选择上样和洗脱溶液时不受载体的局限;(3)良好的机械稳定性,以及均一的粒径和形态;(4)由于需要进一步在此材料表面固定核酸适配体,所以此载体材料的表面最好容易活化;(5)亲水的表面,这样可以最大限度地减小由载体造成的非特异性吸附。目前常用的载体材料有硅[10]、琼脂糖[11]、凝胶[12]、聚苯乙烯[13]、有机或金属聚合物骨架[4]等。载体的种类会影响SPE的表现,Madru等[14]报道了一种基于核酸适配体的SPE柱,是以溴化氰活化的凝胶作为载体,并对比了多种载体,包括链霉亲和素活化的琼脂糖、巯基活化的凝胶以及戊二醛活化的凝胶,结果显示以溴化氰活化的凝胶为载体的吸附剂对目标分析物的保留、选择性、吸附容量以及重复性等参数最佳。

1.2 间隔体的选择

间隔体(spacer)是指核酸适配体与载体之间的间隔连接体,它会在载体材料的表面与适配体之间产生一个化学间隔,以便二者的间隔臂(arm)相连接。间隔体能够影响核酸适配体在载体材料表面的固定密度、载体表面的性质,进而对SPE柱的吸附容量和吸附选择性产生影响[15]。随着间隔体长度的增加,核酸适配体在载体表面的密度下降,与此同时核酸适配体在空间上更易接近目标分析物,会导致SPE柱对目标分析物的捕获效率增加,但吸附容量会有所下降[15,16]。Wang等[17]使用具有防污功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯作为间隔体制备了基于核酸适配体的SPE材料,与未使用该间隔体的材料相比,大大提高了捕获血清中Ramos细胞的选择性和特异性。常用的间隔体还包括3-氨丙基三乙氧基硅烷[18,19]、烷基链[14]、聚乙二醇[13,16]等。

1.3 适配体在载体表面的固定

固定核酸适配体的方法包括非共价键和共价键两种形式。非共价键的方法常采用经典的生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素桥连的方法。该方法很容易构建,并且可买到商业化的相关材料,比如链霉亲和素或亲和素包被的磁珠、多孔硅胶以及聚苯乙烯球等。这种非共价键的方法有很高的效率,并且可以维持材料表面的生物相容性,最大限度地维持核酸适配体的结合能力,已被广泛用于包括SPE在内的分离材料和生物芯片的制备中。该方法操作简单,通常将生物素修饰的核酸适配体与链霉亲和素[11,14]或亲和素[20,21]包被的载体材料混合。但这种方法也有一些缺点,比如重复利用率低、材料的寿命短,尤其当使用有机物修饰的载体材料或者使用高比例有机溶剂作洗脱溶液时,有机材料或有机溶剂会影响生物素与链霉亲和素之间的作用力[11]。有研究[18]曾采用生物素-链霉亲和素连接对比共价连接的方式固定核酸适配体,制备了两种基于核酸适配体的固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)纤维,并对比二者在萃取腺苷时的表现,结果显示以非共价方式固定核酸适配体制备的SPME纤维吸附性能不及共价方式制备的SPME纤维。

共价键合也是固定核酸适配体的常用方法。首先将不同的官能团(比如氨基、巯基、羧基等)引入适配体的一端,然后将这一端与载体表面的某些官能团相互作用形成化学键,从而将核酸适配体固定在载体材料表面。氨基修饰的核酸适配体是最常用的,游离的氨基常共价结合于巯基活化的硅胶[14]、溴化氰活化的凝胶[12,22,23]、N-羟基琥珀酰亚胺活化的凝胶[14]、聚苯乙烯多孔材料[24]或羧基修饰的凝胶[7]上。另外点击化学的方法也常用来固定核酸适配体[10,25]。

通过分析结合前后的上清液可计算核酸适配体在载体表面的结合量,常用的检测方法有丙烯酰胺凝胶电泳法[26,27]、紫外检测法[28,29]以及液相色谱-紫外检测(LC-UV)法[14]。但以上检测方法可能会高估核酸适配体在载体表面的结合量,因为可能存在载体材料对核酸适配体的物理吸附作用。为了避免以上方法的缺陷,可采用离子交换液相色谱法(ion exchange liquid chromatography)同时分析上清液以及清洗材料后清洗液中核酸适配体的量,计算核酸适配体在载体表面的结合量[14]。表1中列举了常用的载体以及核酸适配体在载体表面的固定方法。

1.4 固相萃取的形式

基于核酸适配体的材料用于SPE的形式多种多样,主要包括填充柱[7,11,14,24,28]、开管柱[43,49]、整体柱[19,38,40,42,48]以及SPME纤维[4]。

表1 核酸适配体的固定方法Table 1 Methods of aptamer immobilization

MOF: metal organic framework.

基于核酸适配体的填充柱是采用基于核酸适配体的材料填充至空管制成的SPE柱。填充柱可获得比较高的核酸适配体固定密度,并且具有较高的吸附容量,但可能存在传质速度慢以及容易堵塞等缺陷。很多参数会影响该柱在SPE方面的表现,比如载体材料的属性[14]、适配体的固定方法[11]以及间隔体的长度[15]等。

基于核酸适配体的开管柱是采用共价固定的方式将核酸适配体固定在毛细管内壁,最终形成的开管柱对目标分析物具有选择性结合能力[43,49]。然而与填充柱相比,由于核酸适配体的接枝量很低,开管柱的亲和捕获效率会低很多,另外裸露的毛细管内壁会存在一定程度的非特异性吸附作用,这有可能降低该柱的选择性[43]。毛细管内壁比表面积太小以及上样容量的限制使开管柱在SPE中的应用有所局限。

与填充柱和开管柱不同,基于核酸适配体的整体柱具有高的孔容量、大的比表面积、良好的渗透性以及快的传质速度等诸多优点。Zhao等[29,42]将生物素修饰的适配体固定在整体柱上,用于细胞色素C、凝血酶等蛋白质的捕获与检测。研究显示,整体柱的核酸适配体接枝量[19,25,40]比开管柱[43]和填充柱[24]都要高出很多。

SPME是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的装置,最初在20世纪90年代时由Pawliszyn等[50]发明,在环境[51]、食品[52]、药物[53]以及生物[54]检测方面的应用研究吸引了众多研究者的关注。基于核酸适配体的SPME已有少数报道,比如将腺苷的核酸适配体固定于SPME纤维表面,与商品化的SPME纤维相比,基于核酸适配体的SPME纤维对腺苷表现出更高的亲和能力和卓越的选择性,其萃取效率提高了近20倍[18]。Du等[8]开发了基于核酸适配体的静电纺丝纳米纤维,并采用聚合物丙烯腈/马来酸共聚物将该静电纺丝固定在不锈钢纤维上。该SPME能够选择性地从复杂样品中捕获凝血酶,并具备良好的吸附容量,以及多次重复利用的能力,可以实现稀释20倍的血浆中凝血酶的高选择性萃取。在与液相色谱-质谱(LC-MS)联用时,此SPME纤维可用来检测临床血浆中的凝血酶,这意味着这种基于核酸适配体的SPME技术使复杂样品中目标蛋白质的选择性萃取成为可能。

2 基于核酸适配体的固相萃取过程

基于核酸适配体的SPE过程主要是固定于载体表面的核酸适配体与目标分析物之间的结合与解离的过程。与传统的SPE过程相似,基于核酸适配体的SPE过程包括3个步骤:上样、淋洗和洗脱。与传统SPE柱不同的是,基于核酸适配体的SPE柱不使用时需要置于结合缓冲液中,并保存于4 ℃冰箱。结合缓冲液是指筛选该适配体时使用的溶液,另外保存液中也常加入叠氮化钠。

2.1 上样

上样环境会影响核酸适配体与样品中目标分析物的相互作用,比如温度[55]、离子强度、pH[56]等。这些因素限制了实际样品中目标分析物的直接萃取,可采用适当的溶剂将实际样品稀释,改变其离子强度和pH等,再进行萃取和富集。

在对固体样品中的分析物进行萃取时,往往先采用有机溶剂或者水-有机溶剂来溶解样品。样品中有机溶剂含量较高有可能会影响上样过程中核酸适配体与目标分析物的结合。多数情况下,当样品中有机成分过高时,采用水溶液稀释后再进行萃取[7,26,35,36]。在对液体样品进行萃取时,也常稀释后再萃取,其目的是减小样品的黏度[31,43]以及降低生物样品除蛋白质后有机溶剂的比例[14,32]。比如,在用基于核酸适配体的SPE进行样品中孔雀石绿的萃取时,当样品中甲醇体积分数超过2%,核酸适配体与孔雀石绿形成的复合物稳定性就开始下降[56]；而在赭曲霉素A的萃取研究中,即使样品中的甲醇体积分数高达10%～15%,核酸适配体对赭曲霉素A的捕获效率依然不会下降[7]。

适配体与目标分析物之间的相互作用依赖于核酸适配体的分子构象,而其构象也受到很多因素的影响。一价和二价阳离子的存在可能会改变核酸适配体的构象,目前已有学者做过此方面的研究。比如富含鸟嘌呤的核酸适配体可在钾离子存在时形成G四联体结构[43]。研究者[26]将结合缓冲液中的镁离子替换为钙离子,筛选出了对赭曲霉素A具有更高亲和能力的核酸适配体,并且该核酸适配体与赭曲霉素A之间的亲和能力不会受到溶液中一价离子(钠离子、钾离子)浓度变化的影响,只要溶液中存在钙离子或镁离子,其亲和性就会存在,这个结果提示离子强度对赭曲霉素A与适配体之间亲和能力的影响极小。

2.2 淋洗

SPE过程中,淋洗的目的是将上样后SPE柱中非特异性吸附的基质去除,在此过程中,尽可能不破坏核酸适配体与目标分析物的特异性相互作用,而载体材料[14]、核苷酸[36]、间隔体[17]均会对非特异性吸附做出贡献。可采用不含有核酸适配体的对照材料(如裸露的载体、固定有随机序列单链核苷酸的材料以及包被有间隔体的载体等)进行淋洗过程的优化,并通过分析淋洗溶液中的目标分析物来确定最佳的淋洗溶剂[35,36]。比如,Wu等[36]采用固定有核酸适配体的磁性纳米颗粒作为固相萃取的吸附剂,在优化淋洗条件时,分别采用裸露的磁性纳米颗粒、固定有随机序列核苷酸的磁性纳米颗粒作为对照,优化了淋洗和洗脱的条件。

2.3 洗脱

为达到洗脱目标分析物的目的,需要破坏核酸适配体与目标分析物之间的相互作用。理想的洗脱溶液可以有效破坏目标分析物-核酸适配体复合物,并且不会影响核酸适配体在吸附材料上的固定。常用的洗脱溶液有离液序列试剂(如NaClO4)[48]、变性剂(如尿素、盐酸胍)[43]、清除剂(如乙二胺四乙酸)[26]、水-有机溶剂混合液[11,23]等,另外,提高温度[43]、改变pH[36]等手段对目标分析物的洗脱也有帮助。洗脱方法的选取需要考虑分析物的性质以及核酸适配体的固定方式。比如,对于由共价键固定的核酸适配体固相萃取柱,可采用60%(体积分数)的乙腈洗脱保留在柱上的可卡因;而对于由生物素-链霉亲和素固定的核酸适配体固相萃取柱,只能采用10%(体积分数)的乙腈对目标分析物进行洗脱,过高的有机溶剂比例会破坏核酸适配体的固定；对于后者,可通过升温至60 ℃来提高低有机溶剂比例洗脱液的洗脱能力[14]。

3 目标分析物的检测方法

SPE得到的目标分析物可以通过离线[11]或在线[10]的方式与其他分析方法联用进行检测。常用的检测手段有LC-UV[12]、液相色谱-激光诱导荧光检测(LC-LIF)[7,11,36]、LC-MS[18]、GC-MS[4,30]、MS[47,57]等，这里不作赘述。

4 应用

4.1 小分子

近几年,已经有很多基于核酸适配体的SPE方法用于多种样品中小分子的萃取,比如人血浆中腺苷[18,31]、可卡因[12,14,33,34]以及四环素[32]的萃取。其中在可卡因萃取之前,需要先使用结合缓冲液稀释样品[12];而对于四环素的萃取,则需要先去除样品中的蛋白质[32]。研究最多的小分子是赭曲霉素A[37],文献报道了多种样品中赭曲霉素A的萃取,比如小麦提取物[7,23,26]、姜粉提取物[35]和红酒[11]等。Lin等[4]将核酸适配体固定于富含有机金属骨架的SPME纤维表面,对鱼肉样品中的多氯联苯进行了选择性萃取富集,并结合GC-MS建立了鱼肉中多氯联苯的检测方法,该方法的检出限可达0.003 μg/L。

4.2 大分子

基于核酸适配体的SPE柱萃取样品中的大分子也有少数报道。比如培养基中L-selectin蛋白质的萃取[28],血液中的β1-受体的清除[45],大肠杆菌溶解产物中组氨酸标记白的净化[46],血清[39,41,57]、血浆[44]以及血液[58]中凝血酶的萃取等。

5 总结与展望

目前已经开发了很多基于核酸适配体的SPE材料及装置,由于核酸适配体对目标分析物的高亲和性和高特异性,基于核酸适配体的SPE技术在复杂样品中痕量组分的选择性萃取、分离、纯化和富集中展现出巨大的应用潜力。当然基于核酸适配体的SPE技术的发展也有一定局限,比如目前已筛选出的核酸适配体数量有限、大规模生产核酸适配体的费用太高、核酸适配体自身稳定性不够等。针对以上问题,基于核酸适配体的固相萃取技术的发展趋势有以下两方面。

(1)发展更有效的核酸适配体筛选技术。目前,除了已经发展的SELEX,新的适配体筛选方法如磁性快速适配体筛选协议[59]、毛细管电泳适配体筛选技术[60]已经问世。相信不久的将来会开发出更多更简单、更快速、更容易的适配体筛选方法。

(2)发展更简单且自动化的SPE技术。现阶段,基于核酸适配体的SPE技术还处于发展初期,为达到更满意的SPE效果,基于核酸适配体的SPE技术的发展目标为更小的样品用量、更少的有机溶剂使用量、更简化的固相萃取步骤以及更自动化的萃取装置。此外,多种核酸适配体功能化的吸附剂也是发展方向之一,可用于复杂样品中多种分析物的同时萃取、分离、纯化和富集。

综上所述,随着技术的进步,基于核酸适配体的SPE技术在复杂样品中痕量组分的萃取、分离、纯化和富集领域将具有更广阔的应用前景。

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Research progress of aptamer application insolid phase extraction technique

WANG Weiwei, LIU Suqin, XUE Yun, WANG Yan*, YAN Chao*
(SchoolofPharmacy,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

Aptamers are short single-stranded oligonucleotides within randomly synthesized nucleic acid libraries by a systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Because of specific identification for target molecule, solid phase extraction technique based on aptamers exhibits great potential for extraction, separation, purification and enrichment of trace-target analytes from complex samples, and it attracts more and more attention. This article brings a comprehensive survey of recent developments of solid phase extraction techniques based on aptamers, including the preparation of aptamer-based sorbents, the solid phase extraction procedure and the applications of aptamer-based solid phase extraction. Limits and prospects for aptamer-based solid phase extraction are also discussed.

solid phase extraction (SPE); sample pretreatment; affinity adsorption; aptamer; complex sample; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08033

2016-08-29

上海市科委科研计划项目(15142200200);上海市教育委员会科研创新项目(14YZ170);中国博士后科学基金资助项目(2015M581628).

Foundation item: Research and Development Program of Shanghai Municipal Science and Technology Commission (No. 15142200200); Innovation Program of Shanghai Municipal Education Commission (No. 14YZ170); China Postdoctoral Science Foundation Funded Project (No. 2015M581628).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0099-06

*通讯联系人.Tel:(021)34205673,E-mail:wangyan11@sjtu.edu.cn(王彦);Tel:(021)34205673,E-mail:chaoyan@sjtu.edu.cn(阎超).