冯 旭，王碧霞

(西华师范大学a.生命科学学院;b.环境科学与工程学院,四川 南充 637009)



铬胁迫对葎草雌雄叶片抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响

冯 旭a，王碧霞b

(西华师范大学a.生命科学学院;b.环境科学与工程学院,四川 南充 637009)

采用盆栽法研究不同铬浓度(Cr3+)(分别为0、50、200、300、500 mg/kg)下葎草(Humulusscandens)雌雄叶片抗氧化酶活性的不同影响。结果表明：1)Cr3+胁迫显著影响了葎草雌雄幼苗的SOD、POD、CAT、Pr和MDA含量(P=0.002，P=0.001，P=0.002，P=0.000，P=0.000)，总体上呈现出低促高抑的变化趋势。2)对照处理下，葎草雌株的超氧化物歧化酶(SOD)活性较雄株高，而丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和可溶性蛋白(Pr)含量则比雄株低。3)葎草雌雄幼苗的抗氧化酶活性在低浓度Cr3+胁迫得到了促进，在中度Cr3+胁迫(200～300 mg/kg)下受到显著抑制，膜质过氧化作用的显著增强，且高浓度Cr3+胁迫(500 mg/kg)条件下，葎草幼苗雌雄株的抗氧化活性显著失衡，其抗氧化酶指标的变化出现差异。随着Cr3+胁迫的增加，葎草雌雄幼苗SOD、POD和Pr含量呈先高后低的变化趋势，CAT呈下降趋势，而MDA却呈上升趋势，葎草雌株比雄株具有更积极的响应策略和更强的耐Cr3+机制。

葎草；铬胁迫；雌雄异株；抗氧化酶活性

重金属铬是环境污染中的五毒之一，是一种毒性较大的致畸、致突变剂[1]。近年来，随着铬在印染、电镀、皮革、化工等行业上的广泛应用，使大量的含铬废水、废气、废渣过度排放，导致重金属铬对土壤和农作物的胁迫问题越来越突出，而农田土壤中的铬最终将通过食物链富集危害人类健康，为此研究和分析铬对植物生长发育的影响及其毒害机理已成为当前的研究热点。关于植物对铬胁迫的耐性机制已有报道，抗氧化酶系统是植物应对各种环境胁迫的一种重要抗逆机制，在植物适应逆境的过程中起重要作用。有研究表明，铬污染对薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)、油菜(Brassicajuncea)、烟草(Tobacco)、水稻(Rice)等植物的生理和生长都具有影响[2-6]，低浓度铬胁迫对植株生长产生促进作用，但高浓度铬胁迫则表现出明显的中毒症状，造成植株叶绿素含量减少，SOD活性下降，POD活性和MDA含量上升，且铬胁迫还使李氏禾(Leersiahexandra)叶片的可溶性糖、可溶性蛋白含量等发生改变[7]。由于已有研究多集中在经济作物方面，而对草本植物的研究却较少报道。因此，研究不同浓度铬胁迫对草本植物的抗氧化酶特性的不同影响具有重要意义。雌雄异株植物作为陆地生态系统的重要组分，由于长期的进化，这类植物在生长、空间分布、生殖格局、资源配置等方面已表现出明显的差异[8-11]，该类植物为我国生态系统中的常见物种，如杨属、柳属、槭属、桑属等常见植物，对维持陆地生态系统的稳定性起着重要作用。由于繁殖成本的不同，该类植物的雌雄个体在生理生化特征和环境适应性等方面出现出明显的性别差异。如青杨雄株幼苗POD活性在铝胁迫下显著增加、SOD活性显著降低，雌株对此却无变化[12]，在淹水胁迫下青雌株幼苗的MDA含量比雄株高，SOD活性比雄株低[13]；桑树雄株幼苗的Pr含量和SOD活性施铅后其增加幅度比雌株高[14]，银杏雌雄幼苗的POD、CAT和APX活性在模拟酸雨条件下均显著降低[15]。然而，关于雌雄异株植物的抗氧化酶特性受重金属胁迫影响的性别差异的研究却较少，而葎草(HumulusscandensL.)为桑科(Moraceae)葎草属(Humulus)雌雄异株植物，一年或多年生草本，我国除青海、新疆外，南北各省区广泛分布，主要生长在荒山荒坡及沟边、路旁、荒芜区域。鉴于葎草是常见的雌雄异株草本植物，生长快、分布广，非常适合作为研究铬胁迫对雌雄异株植物抗氧化酶特性的试材。因此，常见的葎草为实验材料，探讨不同铬浓度下葎草雌雄植株抗氧酶活性的性别差异，以期揭示：雌雄植株对铬胁迫的抗氧化机制是否一致？哪种性别具有更强的抗逆性？研究结果可能揭示铬胁迫下雌雄植株间的不同耐性响应策略，从而为进一步研究未来铬污染对雌雄异株植物种群繁衍能力的影响奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2012年10月中下旬采集南充市本地葎草野生种子，于2013年2月20日播种，待生长1个月后，选择长势基本一致的幼苗50株移栽到体积为10 L的塑料盆内，毎盆装入匀质土壤7.5 kg，河沙1.5 kg，毎盆1株，缓苗20 d。于4月15日进行铬胁迫，重金属试剂为Cr3+。参照王爱云等的方法[3]，设浓度为0(对照)、50、200、300 、500 mg/kg共5个处理，将Cr3+按相应浓度配成1 000 mL的溶液，于4月15日一次性缓慢均匀浇灌于土壤中，每处理下雌雄植株各5株重复，对照组(5株)浇施等量清水。为防止溶液渗漏，对照组和处理组塑料盆内均套有塑料袋(土壤置于塑料袋内)。

1.2 测量方法

试验处理结束时，随机选择各种处理下的雌雄植株各5株，并选取各植株上部第3或4片完全展开的向阳叶片用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性、可溶性蛋白含量(Pr)及丙二醛(MDA)含量。

酶提取方法：取0.3 g叶片于预冷的研钵中，加入6 mL预冷的提取缓冲液(磷酸缓冲液pH 7.8，1 mmol/L)，乙二胺四乙酸(EDTA)和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)研磨成匀浆，于4 °C下离心30 min(12 000×g)，取上清液(酶液)用于试验。

1.2.1 SOD活性的测定 采用氮蓝四唑(NBT)比色法[16]，以不照光的对照为空白，测定560 nm波长下的吸光度值，样品中SOD活性 (U·g-1·h-1·FW)=[(DCK-DE)×VT]/(0.5×DCK×W×V1)。

1.2.2 POD和CAT活性的测定 采用愈创木酚法测定[17]，将每分钟OD470和OD240降低0.01定义为一个酶活力单位，分别读取470 nm吸光光度值在3min内每10 s中的变化，以每分钟内D470变化0.01为1个POD活性单位(U)表示，POD活性 (U·g-1·min-1·FW)=(ΔD 470×VT)/(W×VS×0.01×t)；CAT在240 nm处用相同的方法，CAT活性 (U·g-1·min-1·FW) =(ΔD 240×VT)/(W×VS×0.01×t)。

1.2.3 可溶性蛋白(Pr)含量的测定 采用考马斯亮蓝法进行[18]，在595 nm波长下分别测定各样品管吸光度值，并通过标准曲线查得样品中可溶性蛋白的含量，可溶性蛋白(Pr)含量 (μg/g) =(C×VT)/(FW×Vt)。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[19]，测定在532、600和450 nm波长处的吸光度值D532、D600和D450，CMDA=6.45(D532-D600)-0.56 D450，样品中MDA含量 (μmol/g)=(CMDA×VT)/(FW×1 000)。

1.2.5 统计分析 利用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。平均值间的比较采用单因素方差分析方法(One-Way ANOVA)；不同处理间的差异采用Duncan多重比较检验(Duncan’s Multiple Range Test)。显著性水平设定为a=0.05。

2 结果与分析

2.1 Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片SOD活性的影响

从图1(A)中可以看出，对照处理下，葎草雌株叶片的SOD活性比雄株高81.83%。与CK相比，50 mg/kg 时雌雄植株的SOD活性均减少，尤其是雄株显著降低。雌雄植株的SOD活性在200 mg/kg时显著增加，300 mg/kg 时升至最高，而500 mg/kg 时却显著减少，但仍高于对照。因此，Cr3+胁迫显著影响了葎草雌雄叶片的SOD活性(P=0.002)，随着Cr3+胁迫的加重，雌雄株均呈先降后升再降的趋势，且雌株在不同浓度下均高于雄株。

2.2 Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片POD活性的影响

从图1(B)中可以看出，Cr3+胁迫条件下葎草雌雄叶片的POD差异显著(P=0.001)。随着Cr3+浓度的增加，雌雄植株的POD均呈现出先增后降的趋势，高Cr3+浓度下的二者的下降幅度较小。同时，雌雄株的POD在CK时差异不显著，当浓度增至300 mg/kg时雌雄株的POD显著增高，500 mg/kg时二者略有下降，但仍比CK分别高66.67%和61.90%。

2.3 Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片CAT活性的影响

从图2(A)中可以看出，Cr3+胁迫条件下葎草雌雄叶片的CAT活性差异极为显著(P=0.000)。雌株的CAT随Cr3+浓度的增加而增加，雄株则下降。与雌株相比，雄株在CK时显著升高，在低浓度50 mg/kg 时雄株仍明显上升，而在浓度200 mg/kg 时二者同时降低。但300 mg/kg 时雌株却比雄株显著增高，500 mg/kg 时雌株仍较雄株高31.03%。

2.4 Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片可溶性蛋白含量(Pr)的影响

从图2(B)中可以看出，对照处理下，葎草雌株叶片的Pr含量比雄株低33.96%。50 mg/kg 时，雌雄叶片的Pr含量比CK显著增加，200 mg/kg 时，二者均升至最高。但300 mg/kg 时，雌雄植株却同时显著减少，500 mg/kg 时二者继续下降，且下降幅度相同，但仍比CK高。由此可以看出，Cr3+胁迫下葎草雌雄幼苗叶片的Pr含量具有极显著的差异(P=0.000)，二者均呈现出先高后低的趋势。与雄株相比，在低Cr3+浓度时雌株幼苗叶片的Pr较低，中Cr3+浓度时较高，高Cr3+浓度时没有差异。

2.5 Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片丙二醛(MDA)含量的影响

从图3可以看出，CK时，雄株的MDA含量比雌株略高，50 mg/kg 时，雌雄株的MDA分别上升了96.53%和80.51%，200 mg/kg 时，雌雄植株略有下降，300 mg/kg 时二者仍然较高，500 mg/kg 时二者同时略为下降，但仍分别比CK高45.23%和21.62%减少。由此可以看出，雌雄株的MDA在Cr3+胁迫条件均比CK显著增高，二者的变化趋势相相近，但雄株低Cr3+浓度(50 mg/kg)时上升幅度大，高Cr3+浓度(Cr3+)时下降幅度更大雌株，雌株的变化幅度相对较小。因此，Cr3+胁迫显著影响葎草幼苗叶片的MDA含量(P=0.000)，具有极显著的差异性。

3 讨论与结论

正常情况下，植物体内的活性氧代谢保持平衡，但当植物遭受重金属胁迫时，其体内的活性氧产生和清除之间的动态平衡就会遭到破坏。作者研究中，葎草雌雄幼苗在低浓度Cr3+胁迫(50 mg/kg)时，SOD略有下降，POD略有增加，CAT活性和MDA含量显著下降，Pr显著增加。这表明Cr3+胁迫促进了葎草雌雄幼苗体内活性氧的产生，开始启动膜脂过氧化作用。而中度Cr3+胁迫(200 mg/kg和300 mg/kg)则引起葎草雌雄幼苗的活性氧代谢平衡失调， 如SOD和POD均在300 mg/kg时达到最大值，Pr则在200 mg/kg时也升至最高，而CAT却持续下降，MDA也显著高于CK。这说明葎草雌雄幼苗的SOD和POD活性在中度Cr3+胁迫下能协助清除过量的活性氧，维持ROS代谢平衡，保护膜结构，对提高葎草对Cr3+胁迫的耐受性具有重要作用。但高浓度Cr3+胁迫(500 mg/kg)下，葎草雌雄幼苗的SOD、POD、CAT和Pr却比中度胁迫显著下降，但均在不同程度上高于CK。这反映出葎草幼苗在中度胁迫时可能已达到其承受临界点，因此高度Cr3+胁迫下的抗氧化酶系统已严重受损，其生物膜结构破坏加剧，对Cr3+胁迫敏感性受到破坏，因而出现反应迟缓，其抗氧化酶活性下降，MDA也降低。从总体上来看，低浓度Cr3+胁迫对葎草雌雄叶片的抗氧化酶活性有促进作用，高浓度则表现为抑制作用，呈现出先促后抑的趋势。这不仅与铬胁迫下的菖蒲(Acoruscalamus)、白花三叶草(Trifoliumrepens)、高羊茅(Festuceacaarundina)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的抗氧化酶活性变化较为相似[3,20]，而且也与铬胁迫下葎草幼苗叶片净光合速率的变化规律相一致[21]。

还有研究表明，逆境胁迫对雌雄异株植物叶片的抗氧化酶活性的影响差异较大。如铝胁迫使青杨(Populuscathayana)雄株的POD活性显著增加，SOD活性显著降低，雌株MDA含量显著高于雄株，Pr含量则显著低于雄株[12]；且盐胁迫也降低了银杏(Ginkgobiloba)雌雄幼苗的SOD活性，其雌株的POD活性显著降低，雄株无明显变化[15]；而淹水胁迫下的美洲黑杨(Populusdeltoides)雄株却具有更高的SOD、POD活性以及脯氨酸含量[22]。作者研究显示，雌株的SOD、POD、CAT活性和Pr含量在中度Cr3+胁迫下比雄株高，二者的MDA差异不显著，说明雌株的抗氧化酶系统对Cr3+胁迫具有积极的响应，雌雄幼苗的膜脂过氧化作用均显著增强。但在高浓度Cr3+胁迫下，与雄株相比，雌株的SOD、CAT和MDA均较高，而POD却较低，Pr含量没有差异。由于SOD是植物抗氧化系统的第一道防线，能够通过歧化反应使超氧阴离子转变为无毒的O2和毒性较低的H2O2[17]，而H2O2又被POD、CAT等酶进一步分解为H2O和O2。这说明高浓度Cr3+胁迫导致了葎草雌株幼苗体内的超氧阴离子水平显著提高，并通过升高CAT消除H2O2的累积，使细胞膜结构不致受到严重损坏。另一方面，由于MDA含量的高低可以衡量胁迫条件下植物活性氧伤害及细胞膜受伤害的程度，Pr含量的上升则是逆境胁迫下植物渗透调节的重要手段。因此，高浓度Cr3+胁迫使葎草雄株叶片活性氧代谢平衡受到破坏比雌株更强，膜脂过氧化也更严重，雌株具有较高的SOD和CAT活性，表明其抗性比雄株更强。这与葎草雌株个体在Cr3+胁迫下具有较高的光合速率以及更好的自我保护机制相关，也与干旱胁迫下葎草雌株通过增加生殖投入来最大程度保证其繁殖能力的生存策略的研究结果相吻合[10]。

综上所述，低浓度Cr3+胁迫促进了葎草雌雄幼苗的抗氧化酶活性，中浓度Cr3+胁迫显著抑制葎草幼苗的抗氧化酶系统，引起了膜质过氧化作用的加强，而高浓度Cr3+胁迫条件下，葎草幼苗雌雄株的抗氧化活性显著失衡，其不同指标的变化具有不同的差异。因此，Cr3+胁迫下葎草幼苗的SOD、POD和Pr含量呈先高后低的变化趋势，而CAT则呈下降趋势，但MDA却呈上升趋势。随着Cr3+胁迫的增加，葎草雌株具有更积极的响应策略和更好的耐Cr3+机制。

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Effect of Cr(Ⅲ) Stress on Antioxidative Enzymes Different Influence of Male and Female Humulus scandens Leaves

FENG Xua,WANG Bixiab

(a.College of Life Science,b.College of Environmental Science and Engineering,China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009,China)

This paper studied the sex-specific differences of male and femaleHumulusscandensleaves in their antioxidative enzymes under the stress of chromium(0,50,200,and 300 mg/kg Cr3+).The results showed:1)Cr3+stress significantly affected the male and femaleH.scandensseedling in SOD,POD,CAT,Pr and MDA content(P=0.002，P=0.001，P=0.002，P=0.000， P=0.000),with the variation tendency of “low-promotion,high-inhibition”;2)In the control treatment (CK),companied with the males,the superoxide dismutase (SOD) activity of the females was higher,but the malondialdehyed (MDA) content,catalase (CAT),peroxidase (POD) and the soluble protein (Pr) content of the females was lower;3)the antioxidant enzyme activity of male and femaleH.scandensseedling was promoted in low concentration of Cr3+stress(200～300 mg/kg),and inhibited in moderate Cr3+stress(200～300 mg/kg),as well as a significant imbalance in high concentration of Cr3+stress(500 mg/kg),and the changes of their antioxidant enzymes were different. With increase of Cr3+stress,the activities of SOD,POD and Pr content of male and femaleH.scandensseedling showed the “first high and then low” variation tendency,CAT downward trend,but MDA upward trend.The females ofH.scandensseedling has a more positive response strategy than males,and stronger resistance mechanism to Cr3+stress.

Humulusscandens;chromium stress;dioecious;antioxidative enzymes

1673-5072(2016)04-0390-06

2016-01-11

四川省教育厅项目(12ZB142)

冯 旭(1992—)，男，四川巴中人，硕士研究生，主要从事分子生物学方面研究。

王碧霞(1977—)，女，四川南充人，讲师，主要从事环境生态学方面研究。E-mail:696wbx@163.com

Q945.79

B

10.16246/j.issn.1673-5072.2016.04.006