■朱 滔 黄小燕 王根虎

（上海亘泰实业集团，上海201615）

豆粕是世界上应用最为广泛的植物蛋白原料，其具有蛋白含量高、氨基酸较为平衡、动物消化吸收利用好等优势，在动物饲料中广泛使用。然而在使用豆粕饲喂幼龄动物时，其中残留的抗营养因子可以引起严重的过敏反应[1]。特别是在仔猪断奶过程中，由于受到多种应激因素的影响，导致断奶仔猪综合征，降低养殖效益。豆粕中存在的主要抗营养因子包括抗原蛋白、寡糖、胰蛋白酶抑制因子、脲酶[2]。因此通过技术手段降低豆粕中抗营养因子含量是提高豆粕应用价值的重要手段。通过微生物发酵生产高质量发酵豆粕[3]，既可以减少豆粕中的抗营养因子，还可以提高饲料适口性，具有重要的经济价值，受到饲料厂的广泛欢迎。然而市场上发酵豆粕产品众多，品质不一，产品品质评估标准十分重要。因此本文简介了如何综合评估发酵豆粕质量，以期为选择合适的发酵豆粕提供理论依据。

1 大豆蛋白质的组成和溶解性

1.1 大豆蛋白质的组成

大豆蛋白质的组成及其特性见表1。大豆蛋白质主要由球蛋白组成，占总蛋白含量的90%以上，其余还含有部分清蛋白，占总蛋白的含量仅为5%左右。大豆球蛋白根据蛋白质沉降系数分类，可分为4个组分，即2S、7S、11S、15S[4]。其中 15S组分为多聚体大豆球蛋白，占球蛋白总量的9.1%左右。11S组分为大豆球蛋白，占球蛋白总量的41.9%。7S组分占总球蛋白的34.0%左右，包括β-伴大豆球蛋白（占总球蛋白30%左右）、γ-伴大豆球蛋白、α-淀粉酶、脂肪氧化酶、凝集素[5]。2S组分包括α-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、细胞色素，占总球蛋白含量约15.0%。

表1 大豆中蛋白质的组成

1.2 大豆蛋白质的溶解性

蛋白质是有机大分子化合物，在水中以分散状态存在，其在水中的融溶量称为蛋白质的溶解度。由于溶解度特性对大豆蛋白质的提取、分离和纯化影响非常大，所以大豆蛋白质的溶解度大小在实际应用中非常重要。同时大豆热加工中蛋白质变性的程度也可以通过蛋白溶解度的变化来评判。

大豆蛋白质的等电点为4.2～4.6之间，其在水溶液pH值为等电点时溶解度最低，随着水溶液pH值的提高或降低蛋白质溶解度急剧增长[6]。图1为溶液pH值对大豆蛋白质溶解度的影响。

从图1可以看出，当溶液pH值在大豆蛋白质等电点时（pH4.2左右），蛋白溶解度最低，只有8%左右，溶解的可能为非蛋白氮及清蛋白。随着pH值的提高，大豆蛋白的溶解度快速提高，在溶液pH值提高到12以上时，大豆蛋白的溶解度提高至95%以上。大豆蛋白质在水溶液中的溶解度不仅受到pH值的影响，热加工、水温、水溶液中盐离子的含量等都会影响溶解度。

图1 不同酸碱处理及pH值对大豆蛋白质溶解度的影响[7]

2 发酵豆粕的性质

发酵豆粕是以大豆粕为主要原料（≥95%），以麸皮、玉米皮等为辅助原料，使用农业部《饲料添加剂品种目录》中批准使用的微生物菌种进行固态发酵，并经干燥制成的蛋白质饲料原料产品。从2013年开始实施的中国农业行业标准NY/T 2218-2012规定的发酵豆粕技术指标包括：水分≤12.0%、粗蛋白质≥45.0%、粗纤维≤5.0%、粗灰分≤7%、尿素酶活性≤0.1 U/g、酸溶蛋白（占蛋白含量）≥8.0%、赖氨酸≥2.5%、水苏糖≤1.0%[8]。此行业标准主要目的是规范市场，防止假发酵豆粕进入市场。但是仅仅这些指标并不能合理评估不同发酵豆粕产品的价值。

发酵工艺对豆粕整体品质的影响包括以下4方面：①微生物分泌的酶将大分子物质降解为小分子（包括不良寡糖的降解、大分子蛋白降解为小分子肽链）；②微生物利用碳水化合物无氧发酵产生乳酸；③固体发酵时水分一般为30%～50%，发酵完成后将产品干燥，水分控制在5%～10%；④有些厂家在豆粕发酵前，有蒸煮消毒的前处理工艺。

从发酵豆粕降解豆粕中的抗营养因子出发，国家制定了发酵豆粕的行业标准，但是却很少考虑到整个发酵工艺对豆粕质量的影响，特别是干燥和/或蒸煮对豆粕氨基酸利用率的影响。由于过度热加工对于豆粕氨基酸的利用率影响很大，因此发酵豆粕中沿用了豆粕质量评价体系中的蛋白溶解度这一指标，用于衡量豆粕在发酵过程中是否被过度热处理。表2、表3表示豆粕和发酵豆粕的营养指标及氨基酸的消化率。

表2 普通豆粕、发酵豆粕的营养物质组成(%)[9]

表3 普通豆粕、发酵豆粕的氨基酸含量及其消化率(%)

从表2、表3中可以看出，发酵豆粕的营养价值（如粗蛋白、氨基酸含量），显著高于普通豆粕。但是从日粮配制角度上来说，发酵豆粕赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸回肠末端标准消化率较浸提豆粕降低了14.77%、12.05%、1.12%，而氨基酸平均消化率从豆粕的87.39%降低至81.11%，平均降低7.19%。据分析，发酵豆粕氨基酸消化率降低的原因可能是其在生产过程中受到过度热加工（蒸煮和/或干燥）的影响，降低了氨基酸的利用率。因此有必要在原有评估体系中增加对于热加工程度的评估。

3 发酵豆粕评估体系

由上分析所知发酵豆粕的评估主要分为两方面：①发酵豆粕中抗营养因子的降解程度；②发酵豆粕蛋白受热加工的影响程度。现阶段行业内用的比较多的主要指标有：抗原蛋白、酸溶蛋白、不良寡糖、乳酸含量、蛋白溶解度。其中抗原蛋白和不良寡糖是直接表明抗营养因子消除情况，而酸溶蛋白、乳酸含量主要用来判断发酵是否充分的两个指标，蛋白溶解度是指发酵豆粕是否加热过度的指标。一些饲料厂在使用时只注重某一项指标，比如说抗原蛋白，但是却忽略了发酵豆粕的整体质量评估。我们认为需要对发酵豆粕的质量进行综合判断，改进现有检测方法，准确的评估发酵豆粕质量。

杨玉娟等(2016)和周天骄等(2015)对总共308个不同豆粕和发酵豆粕样品中抗营养因子含量的检测结果（见表4）。从表4中可以看出，不同豆粕样品和发酵豆粕样品的抗营养因子含量差异非常大。杨玉娟等（2016）的检测结果表明，发酵豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖的含量平均值分别为 54.7、37.6、7.5、1.93、5.19 mg/g，较豆粕中抗营养因子含量有明显下降，但是不同发酵豆粕之间变异非常大，表现在大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖的变异系数分别为77.7%、95.2%、101.3%、169.4%、150.9%。这两篇论文表明不同发酵豆粕对于抗营养因子的消除率相差很大，因此有必要对不同发酵豆粕的质量进行评价。

发酵豆粕生产过程中的蒸煮和干燥等湿热处理工艺可以使蛋白质变性（李岩涛，2013），蛋白质天然结构被破坏，二硫键断裂，肽链展开，包埋的疏水基团开始暴露，并且与其它化合物的基团形成分子间或分子内的结合键，从而降低其蛋白溶解度[12]。更为重要的是高温能使氨基酸的氨基和还原性碳水化合物起反应（美拉德反应），降低氨基酸的含量和利用率。在所有氨基酸中赖氨酸是最容易发生美拉德反应的氨基酸，其暴露在外的ε-氨基能与还原糖的羧基相结合。除赖氨酸外，蛋白质分子中的其它氨基酸（如精氨酸、组氨酸和色氨酸）也会受热加工过度的影响，可以与氨基酸发生反应的还原性化合物还包括醛和酮。美拉德反应的后期，会形成褐色素或类黑素，这也是豆粕经过过热加工后颜色变深的由来。美拉德反应程度取决于水分活度、温度、pH值、加热时间，以及底物的种类和可利用程度[13-14]。因此发酵豆粕受热损伤的程度可以通过产品颜色、蛋白溶解度、赖氨酸/粗蛋白比值来进行综合评估。

表4 豆粕与发酵豆粕中抗营养因子含量（mg/g）

3.1 发酵豆粕蛋白溶解度的检测

蛋白在溶液中的溶解基本上是所有检测手段的前处理方法，因此有必要在检测之前，对蛋白的溶解度有着深入的了解，才能全面认识发酵豆粕的评估体系。豆粕中蛋白溶解度、酸溶蛋白以及抗原蛋白检测的原理都与大豆蛋白的等电点以及其溶解性高度相关。大豆蛋白在溶液中的溶解性是检测任何指标的先决条件。因为大分子蛋白在等电点下溶解度最低而小分子蛋白可以在此pH值溶液中溶解，从而将大分子蛋白沉淀下来，将水溶液中粗蛋白含量认定为发酵豆粕中小肽含量，因此也称为酸溶蛋白。

测定豆粕蛋白溶解度所用的溶液为0.2%氢氧化钾，溶液pH值为12.5，在此条件下大豆的蛋白溶解度在95%左右，而大豆经过浸提或压榨、烘干等热加工过程后，由于蛋白质变性和美拉德反应，豆粕的蛋白溶解度降低至70%～85%。豆粕经过发酵后有3大变化：①乳酸的产生；②大分子蛋白的降解；③烘干；这三个因素都会导致发酵豆粕蛋白溶解度的变化：①发酵豆粕中酸的存在会与氢氧化钾中和，降低溶液的pH值，从而降低蛋白溶解度。方华等（2014）的研究表明，发酵过程中产生的2%～4%的有机酸可以导致蛋白溶解度检测值偏低10%～15%；②大分子蛋白降解为小分子蛋白（酸溶蛋白）后，小分子蛋白在碱性环境条件下溶解度也有下降，见图2；③随着烘干温度的升高和时间延长，发酵豆粕蛋白溶解度随之降低。

发酵豆粕检测蛋白溶解度的目的是确认热加工的程度，防止过度烘干，影响发酵豆粕中氨基酸的消化率。但是因为乳酸以及酸溶蛋白影响蛋白溶解度，并且不同厂家发酵豆粕产品中乳酸和酸溶蛋白含量完全不同，所以在检测发酵豆粕蛋白溶解度时，需要改善检测方法，消除乳酸及酸溶蛋白对蛋白溶解度检测的影响。从而使蛋白溶解度成为反应发酵豆粕受热加工影响程度的一项准确的评价指标。

豆粕的蛋白溶解度控制在70%～85%之间，近年来随着油脂加工技术的改进，豆粕的蛋白溶解度有提高的趋势。方华等（2014）[15]的研究表明，发酵过程中蒸煮温度超过100℃、干燥温度超过60℃，对发酵豆粕的蛋白溶解度影响巨大[15]。结合实际检测数据，我们建议发酵豆粕蛋白溶解度最好高于70%，最低不低于65%。

3.2 发酵豆粕抗原蛋白的检测

大豆中的抗原蛋白有很多，目前研究比较充分的大豆抗原蛋白主要有大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，其沉降系数分别为11S和7S，分别占大豆总蛋白的36%和27%左右。而根据免疫反应活性，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别占40%和27.9%左右[17]。因此我们现阶段的主要手段就是通过检测大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量，间接推断发酵豆粕中抗原蛋白的降解程度。大豆中除大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白外，还有其它的抗原蛋白存在。此外，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的不同亚基致敏能力也不同。Ogawa等（1995）[18]和Fu等（2007）[19]研究表明，β-伴大豆球蛋白的α亚基是大豆致敏蛋白中最重要的一种，而α亚基和β亚基并不是致敏蛋白。大豆球蛋白的总体致敏能力低于7S蛋白。研究表明，11S球蛋白的酸性多肽亚基均为过敏蛋白，而碱性多肽很少与大豆过敏患者血清产生免疫反应[20]。

图2 不同pH值下大豆分离蛋白和大豆水解蛋白的溶解度[16]

加工处理能影响大豆蛋白的致敏性。龙国徽（2015）的研究表明，120℃湿热处理能显著改变大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的结构，引发其免疫活性的变化，并且进一步的研究发现，大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白结构热稳定性更好，结构不易破坏[21]。

在此背景下，酶联免疫吸附法（ELISA）通过制备抗大豆主要抗原蛋白抗体，建立抗原蛋白定量测定方法，具有高度专一、高灵敏性等优点，近年来是抗原蛋白检测的主要手段。ELISA法检测抗原蛋白，第一步是将蛋白用提取液进行提取，通常提取液的pH值都在碱性偏中性。考虑到发酵豆粕一般偏酸性，提取时溶液pH值可能偏低。并且发酵豆粕0.2%KOH溶解度低于豆粕，好的发酵豆粕溶解度在70%左右，很多发酵豆粕甚至只有50%～60%。考虑到如上两个影响因素，检测时提取出来的蛋白含量可能更低，只有50%不到。在此条件下检测出来的抗原蛋白含量仅供参考，只能从一定程度上用来评估不同发酵豆粕产品的质量。

发酵豆粕中抗原蛋白的降解、蛋白溶解度的降低、产品中的有机酸都能导致抗原蛋白检测结果低。SDS-page法蛋白条带颜色浅、ELISA法定量检测值低都只能说明提取出来的抗原蛋白含量低，并不能完全说明抗原蛋白已经被降解。将抗原蛋白作为准确反映发酵豆粕蛋白质量的指标需要改善检测方法（消除酸和热加工对溶解度的影响），提高蛋白质在缓冲液中的溶解度，充分将发酵豆粕中的蛋白（特别是大分子蛋白）提取出来。

SDS-PAGE法检测抗原蛋白的第一步与ELISA方法相同，都是将发酵豆粕中的蛋白提取出来。检测方法中存在的问题也与ELISA法相同。但是不同的是加热处理可以使大豆蛋白变性，变性后的蛋白质由于结构发生变化，在聚丙烯酰胺凝胶上不能结合，通过电容检测不到抗原蛋白的存在[22]。

3.3 发酵豆粕中酸溶蛋白的检测

发酵豆粕中酸溶蛋白的检测方法来源于大豆肽粉国标GB/T 22492-2008[23]。主要原理是利用大豆中的大分子蛋白在酸性条件下易被沉淀，而分子量较小的蛋白质（肽、游离氨基酸、非蛋白氮）可以溶于酸性溶液中。因此将样品用三氯乙酸进行处理，将大分子蛋白沉淀下来，检测小分子蛋白的含量，以此为指标表示豆粕中大分子蛋白的降解程度。然而与大豆肽粉不同的是，发酵豆粕中含有有机酸，可以降低溶液中的pH值，从图1中可以看出来，大豆蛋白的溶解度在pH值低于等电点情况下的溶解度也会迅速增加。如果产品中有机酸含量不同，溶液的pH值也不同，对于酸溶蛋白的检测结果也有影响。因此需要消除有机酸对溶液pH值的影响，再对发酵豆粕的酸溶蛋白含量进行检测。

3.4 其他反应热加工程度的指标

热加工对豆粕的影响可以表现在蛋白溶解度指标的变化，但是随着热加工程度的逐渐加深，美拉德反应的加重，豆粕的很多物质（如赖氨酸）含量都会发生变化。豆粕受热损伤，赖氨酸浓度降低，而粗蛋白的浓度不会发生变化。随着热加工程度的加深（温度升高、时间延长、高压蒸汽的存在），豆粕中赖氨酸/粗蛋白比值随之降低。González-Vega等（2015）的研究表明，随着高压蒸汽处理时间的延长，赖氨酸/粗蛋白比例从6.29%降低至5.57%[24]。并且Stein等(2009)[25]和Cozannet等（2010）[26]都报告了热损伤DDGS中赖氨酸/粗蛋白比值的降低。因此可以通过计算赖氨酸/粗蛋白值来判断发酵豆粕的热损伤程度。从表2中可以计算浸提豆粕和发酵豆粕的赖氨酸/粗蛋白比值分别为6.29%和5.81%，说明发酵豆粕中热损伤程度加深，这也与发酵豆粕氨基酸的消化率低于浸提豆粕的现象相吻合。此外还有报道表明，可以通过检测糠氨酸的量来评估豆粕热损伤程度（González-Vega等，2015）。

4 结语

综合以上讨论，发酵豆粕作为一种常见的原料，在市场上使用非常普遍，但是现有的检测方法均来源于其它产品。发酵过程中豆粕产生了一系列的变化，包括蒸煮、大分子蛋白和寡糖的降解、酸的产生、进一步干燥，使发酵豆粕明显有别于其它大豆类产品。其它产品的检测方法对于发酵豆粕来说并不是十分合适，需要对检测条件进行调整，以符合发酵豆粕的实际情况。在此结合实际情况，发酵豆粕的推荐评价标准为：蛋白溶解度≥70%、酸溶蛋白（占蛋白比）≥20%、大豆球蛋白+β-伴大豆球蛋白≤10%、水苏糖+棉籽糖≤1%、赖氨酸/粗蛋白≥6.0%。